木聚糖酶微生物发酵生产的研究进展

孙孝梅，黄建忠

（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350108；2.工业微生物教育部工程研究中心，福建 福州350108；3.福建省现代发酵技术工程研究中心，福建 福州 350108）

木聚糖酶是一类可特异性降解木聚糖的酶类，主要由β－1，4－内切木聚糖酶和β－木糖苷酶组成［1］，广泛分布在自然界中，细菌、真菌、酵母、放线菌、海洋藻类、反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、各种无脊椎动物和陆地植物组织中都有存在［2］。木聚糖酶在半纤维多聚糖资源的利用及工业应用方面有巨大的潜力，如该酶在造纸工业中可以水解半纤维素释放木素，可增加纸张白度，改善纸张性能，同时降低漂白时含氯化物的用量，大大减少环境污染［3］；在食品工业中可作为面包的改良剂［4］，增大面包体积，还可以利用木聚糖酶降解木聚糖生产低聚木糖等高附加值的产品［5］；在饲料工业中，木聚糖酶作为动物饲料的添加剂，可以降解植物细胞壁结构，提高饲料的转化率，减少肠道疾病，提高动物生长性能等［6］。因此，开展木聚糖酶的开发和生产研究具有极大的商业价值和广阔的应用前景。

而在众多木聚糖酶来源中，人们研究和应用最多的是微生物木聚糖酶。已报道的能产木聚糖酶的微生物主要有细菌、真菌、放线菌和酵母。国内外研究较多的产木聚糖酶的微生物是木霉、青霉、曲霉、链霉菌等真菌和芽孢杆菌。丝状真菌木聚糖酶的表达量往往高于细菌和酵母［7］，而且大多是胞外酶，易于发酵后的分离纯化，但所产酶系较为复杂，常常伴随高活性纤维素酶的产生。目前工业上使用的木聚糖酶也主要是利用这些微生物发酵而成。由于微生物木聚糖酶在处理半纤维素方面安全有效，因而大力寻找和开发经济、高效的微生物木聚糖酶具有重要的意义。

1 木聚糖酶高产菌种的分离和选育

菌种的分离和选育是木聚糖酶发酵生产的基础性工作，菌种能否成功选育是木聚糖酶能否具有工业化价值和发酵过程能否成功的关键因素。

1.1 菌种筛选

我国对木聚糖酶的研究起步较晚，且普遍存在生产的木聚糖酶活性较低等问题，因此，筛选木聚糖酶活性较高的生产菌种已成为研究的关键。产木聚糖酶的微生物种类很多，陆地及海洋微生物均有分布。自然界中的土壤是取之不尽的菌种宝库，因此木聚糖酶生产菌株大多从富含半纤维素的土壤中分离得到，如垃圾场、造纸厂及长期堆放木聚糖含量较高的木质纤维材料土壤等。纯种分离常采用平板分离法，包括划线法和稀释涂布法。菌种初筛通常采用透明圈法，在平板培养基中加入溶解性较差的底物（如木聚糖）作为唯一碳源，根据菌落周围是否出现透明的水解圈及透明圈的大小来区别产酶菌株。另外，刚果红透明圈法也是分离产酶菌株常用到的一种筛选方法。在初筛的基础上，利用酶活测定法进行复筛，从而筛选到产酶量高且性能更符合生产要求的菌种。

陈和秀等［8］以甘蔗渣半纤维素为碳源，从垃圾场土壤中分离到一株木聚糖酶活力较高的菌株。根据对菌株形态学分析和18SrDNA序列分析的结果，将该菌株鉴定为曲霉HQ3，通过固态发酵的木聚糖酶活力最高可达3421U／g干曲。孙丰慧等［9］利用刚果红透明圈法，从造纸厂碱性土壤中筛选到一株木聚糖酶生产菌株X24－14，经培养特性研究及16SrDNA序列比对分析，初步鉴定为纤维菌属（Celulosimicrobium），经发酵条件优化后，该菌产生的木聚糖酶最大活力为2204U／mL，该酶最适反应温度为60℃，具有较宽的pH作用范围，在pH 4.2～9.4范围内能保持较高的酶活力。张世敏等［10］采用透明圈法，从土壤中筛选到一株产酸性木聚糖酶的黑曲霉菌株F19，通过单因子及正交试验确定了最佳产酶培养基，在最适培养条件下，摇瓶发酵的木聚糖酶活性最高为1303.56 U／mL。Dheeran P等［11］从白蚁内脏中分离到一株木聚糖酶高产菌株，经生理特征和16SrRNA序列分析，该菌株被鉴定为麻浸类芽孢杆菌（Paenibacillusmacerans），所产酶具有较好的温度（40～90℃）稳定性和pH（3.5～9.5）稳定性，在最适温度（60℃）和最适pH（4.5）下，其最佳酶活力为（4170±23.5）U／mg。

1.2 诱变育种

诱变育种是微生物改良的常用方法，而且是大多数工业微生物育种上最重要、最有效的技术。通常野生型的木聚糖酶生产菌株产量较低，生产能力远远不能满足工业化的生产要求，有必要对其进行诱变育种，以期得到酶活较高的菌株。目前，研究者大多采用紫外线、微波、亚硝基胍、硫酸二乙酯等理化诱变方法获得高产木聚糖酶菌株，其中紫外诱变是最常用和最有效的诱变剂之一。此外，利用多种诱变剂依次对产酶菌株进行复合诱变处理也是木聚糖酶高产菌株诱变育种中经常采用的技术。木聚糖酶诱变育种的工作主要包括诱变剂及其剂量的选择、正突变株的筛选和高产木聚糖酶突变株产酶最佳条件的调整。近几年来，木聚糖酶高产菌株的诱变育种得到了很大的发展。

杨健等［12］以球毛壳霉菌（chaetomiumglobosumAS3.3601）为出发菌种，通过紫外诱变的方法筛选到一株木聚糖酶高产突变株Z30－56，其最高酶活可达9850U／mL，比出发菌株AS3.3601提高53.7%，并且遗传性能稳定。张新峰［13］等同样采用紫外诱变技术，对嗜热真菌（Thermomyces lanuginosusDSM10635）原生质体进行诱变处理，通过初筛和复筛，最终选育出3株遗传性能稳定的木聚糖酶高产诱变株，木聚糖酶的酶活分别比出发菌株提高了26.5%、37.78%、28.2%。曾莹等［14］以黑曲霉（AspergillusnigeAn54）为出发菌株，经紫外（UV）和硫酸二乙酯（DES）复合诱变处理原生质体，以nystainr和2－D－Gr为遗传标记，定向筛选得到一株木聚糖酶高产菌株An54－A3，该突变株在以玉米芯和稻草为主要原料的基质上30℃下培养65h左右，木聚糖酶活力达4447.44 U／g鲜曲，比出发菌株的产酶能力提高45.85%。徐同宝等［15］以黑曲霉（AspergillusnigerXE6）为出发菌株，采用微波（MW）和硫酸二乙酯（DES）诱变处理，选育出一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶菌株mAnl，该突变株经固态发酵，所产木聚糖酶的酶活为81151U／g，比出发菌株的酶活提高了34.88%。

1.3 基因工程育种

随着生物技术的发展，利用基因工程手段克隆木聚糖酶的基因，然后将基因导入到合适的宿主中，并研究其基因的表达调控，不但可以大幅度提高木聚糖酶的产量，而且能够改变酶的性质。国内外已有许多研究者将基因工程技术应用与木聚糖酶生产菌株的选育中，许多来自细菌或真菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌等表达系统中成功表达。其中，大肠杆菌表达系统因具有遗传背景清晰、生产繁殖快、培养条件简单、转化和转导效率高、成本低廉与可以快速大规模表达目的蛋白等优点而备受青睐。

付正等［16］利用基因工程技术将嗜热真菌（ThermomyceslanuginosDSM10635）的木聚糖酶1YNA的基因xyl克隆到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）后获得了能成功表达木聚糖酶的工程菌，该工程菌表达的木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃，最适pH 值为6.0，其在75℃，pH 值为6.5的条件下失活处理30min后仍残存有30%的酶活，具有很好的热稳定性。Kui H等［17］将NesterenkoniaxinjiangensisCCTCC AA001025的β－1，4内切木聚糖酶基因xyn11NX克隆至大肠杆菌中，并成功实现分泌表达。对重组酶酶学性质分析表明，最适反应pH值为7.0、温度55℃。该重组酶的适用pH范围较广，在pH 5.0～11.0范围内酶活较稳定。且其热稳定性较好，该酶在60℃保温1h后，其相对酶活仍可维持在80%以上。在90℃保温15min后，仍可残留40%以上酶活。

此外，利用蛋白质工程的方法可以进一步提高工程菌的表达水平和改善其热稳定性。目前用于木聚糖酶蛋白质工程的相关技术主要有定点突变技术、木聚糖酶分子的化学修饰和蛋白质体外定向进化技术［18］。M.Ebrahimi等人［19］采用易错 PCR和定点突变技术获得了新型耐高温嗜碱芽孢杆菌（Bacillushalodurans）突变株，该突变株产生的木聚糖酶在75℃条件下仍具有较高活性。

2 木聚糖酶的发酵生产

微生物木聚糖酶产量的高低不仅取决于菌种的好坏，还取决于它的发酵生产工艺。发酵工艺的选择及优化对木聚糖酶的工业化生产具有重要的意义。目前，微生物木聚糖酶的发酵生产工艺主要有两种：固态发酵和液态发酵。

2.1 固态发酵

固态发酵技术发展已久，早在古代中国就已经应用固态发酵技术制曲酿酒、腌制食品和肥料堆积等。利用固态发酵技术生产木聚糖酶是一项经济实用的新型发酵技术。微生物所产木聚糖酶通常为诱导酶，许多半纤维素资源，如麸皮、玉米芯、甘蔗渣、秸秆等对某些特定微生物产酶菌株具有很好的诱导作用，固态发酵采用这些廉价的农业废弃物为原料，发酵成本较经济，而且操作设备简单，生产效率高，整个生产过程中废液少，环境污染较轻。随着人们对节能环保问题的重视，利用固态发酵技术生产木聚糖酶具有较好的经济和环境效益。但固态发酵在发酵过程中一些发酵参数不易控制，发酵周期较长，发酵过程易发生污染，传质不均匀，产品回收率较低等。木聚糖酶固态发酵工艺的研究主要包括发酵培养基成分、料水比、发酵温度、初始pH、接种量等。

周晨妍等［20］对黑曲霉产木聚糖酶的固态发酵条件进行了优化，确定了最优发酵培养基成分为麸皮：玉米芯＝5∶3、（NH4）2SO41.0%、KH2PO40.2%、CaCl20.1%、MgSO40.1%，料水比1∶1.7；最佳培养条件为接种量1.0%，pH 值为7.5，培养温度为28℃，培养时间为60h，其间翻曲2～3次。在此最佳工艺条件下，木聚糖酶的活力可达14698.21U／g。Assamoi等［21］对Penicilliumcanescens产木聚糖酶的固体发酵条件进行了优化，该研究以颗粒大小5mm的大豆油饼为培养基碳源，并添加含有3%酪蛋白和4%Na2HPO42H2O的营养液，初始含水量为80%，30℃培养7天后，用三角瓶固态发酵的木聚糖酶酶活达到了18895±778U／g，而用塑料袋发酵产生的木聚糖酶活为9300±589U／g。Pandya［22］对实验室选育的AspergillustubingensisJP－1菌株固态发酵产木聚糖酶条件进行了研究，确定了利用未经处理的小麦秸秆添加MS营养液为主要基质进行固态发酵生产木聚糖酶的适宜条件：pH 6.0，料水比1∶5，培养温度30℃，在250mL三角瓶中固态培养8天后，木聚糖酶活力可达（6887±16）U／g。

2.2 液态发酵

与固态发酵相比，液态发酵在生产的过程中可实现实时检测与自动控制，易于扩大生产规模，且不易染杂菌，生产效率高，产品的分离比较简单，但会产生大量污水。木聚糖酶液态发酵生产中发酵效果除了受菌种自身产酶性能的影响外，主要受培养基组成成分、种龄、接种量、发酵温度、pH、溶氧等条件的影响。研究主要通过各种试验设计方法，如单因素试验设计、正交试验设计、响应面分析法等确定最优产酶培养基组成及最佳培养条件，从而提高木聚糖酶的产量。

王涛等［23］在5L发酵罐上对毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件进行研究，确定了5L罐发酵的最佳种龄是24h，最佳接种量是10%。通过正交设计试验，得到5L罐发酵产木聚糖酶的工艺条件：pH值为5.5，温度为30℃，空气流量3L／min，搅拌转速为300r／min，发酵130h，毕赤酵母发酵产木聚糖酶的酶活为2780U／mL。吕世锋等［24］通过单因素试验与响应面分析法对黑曲霉液体发酵产木聚糖酶的发酵条件进行了研究，当培养基为麸皮40g／L，（NH4）2SO44g／L，KH2PO43g／L，Mg－SO40.8g／L，吐温－80 1g／L，初始pH 值5.0，接种量8.0%，培养温度30℃，在此条件下发酵木聚糖酶酶活达1456.27U／mL。Nagar S等［25］对BacilluspumilusSV－85S液体深层发酵产无纤维素酶活且耐碱性木聚糖酶的发酵条件进行了研究。该研究表明，以麸皮作为培养基，接种量1%，种龄18h，pH 6.0，37℃发酵36h，所产木聚糖酶活力达到最高为（2995.20±200.00）U／mL。该酶具有很好的pH稳定性，在37℃，pH 5～11范围内处理1h，仍残留100%酶活力，而且所产酶无纤维素酶活性。

目前，国内外对木聚糖酶的发酵放大工艺方面的报道不多，许多研究还停留在实验室摇瓶发酵阶段。今后，应以摇瓶中最优培养条件作为小型发酵罐的初始培养条件进行初步放大，通过对小型发酵罐的发酵工艺进行优化后，逐级放大到工业规模的发酵。

3 展望

由于木聚糖酶存在较大的商业应用价值，有关木聚糖酶的微生物发酵生产一直是人们关注和研究的热点。我国对木聚糖酶的研究起步较晚，现在仍存在出发菌种所产木聚糖酶的产量低、酶学性质不够优良等缺陷，使其大规模工业化生产和应有范围受到很大的限制。因此，从天然微生物中筛选高木聚糖酶产量并具有优良性状的菌株，再通过诱变育种或结合基因工程育种手段，进一步提高木聚糖酶的表达水平就显得尤为关键。另外，随着蛋白质工程的迅速兴起，也为木聚糖酶蛋白分子进行定向分子改造，并改善其相应酶学性质提供了可能。而且我国具有丰富的玉米芯、玉米秸秆、麦麸、蔗渣等富含半纤维素类农林纤维废弃物，是一种用于生产木聚糖酶潜在的天然混合碳源，如能将其推广应用于木聚糖酶的生产中，不仅可以降低木聚糖酶的生产成本，获得巨大的经济效益，还可以帮助处理农业废弃物，保护环境。因此，通过对木聚糖酶发酵工艺的优化，提高木聚糖酶的生产力也是一个非常迫切的工作。

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