CyclinE和cdk2在眼睑基底细胞癌组织中的表达及其意义

陈志雄 黄 琼

（1武汉大学人民医院老年病科； 2武汉大学人民医院眼科 武汉430060）

眼睑基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是眼睑恶性肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤，约占眼睑恶性上皮性肿瘤的85%-95%。眼睑基底细胞癌是生长缓慢的肿瘤，病程一般较长，最长可达20年。虽然其发病缓慢，恶性程度和转移性较低，但发病人数的逐年增多，已引起人们高度重视［1］。

近年来，随着细胞周期的分子调控机制研究的深入及阐明，细胞周期紊乱在恶性肿瘤的发生发展过程中的作用受到人们重视［2］。细胞周期蛋白E（cyclinE）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（cdk2）是细胞周期中G1期和S期重要调节因子［3］，但目前两者与眼睑基底细胞癌之间的关系尚不清楚。

采用免疫组织化学方法研究CyclinE和cdk2在眼睑基底细胞癌组织中的表达，探讨CyclinE和cdk2在BCC发生、发展机制中的作用，为治疗基底细胞癌提供理论依据。

材料和方法

1.材 料

1.1 标本来源

收集武汉市中心医院和武汉大学人民医院病理科2002-2009年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌（basalcell carcinoma，BCC）标本共20例，另取癌周围正常组织5例作对照。基底细胞癌发病年龄20-68岁。所有标本均经10%甲醛固定，常规HE染色，光镜观察，病理检查确诊。

1.2 主要试剂

1.2.1 浓缩型兔抗人CyclinE多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）

1.2.2 浓缩型兔抗人cdk2多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）

1.2.3 超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）

1.2.4 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）

1.3 主要仪器

YWY781型医用微波仪，250W，50Hz，浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。

2.方 法

2.1 常规HE染色

取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

2.2 免疫组织化学S-P法检测CyclinE和cdk2抗原

主要步骤：组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；p53采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

3.免 疫组织化学结果判断

3.1 CyclinE和cdk2抗原以胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。

3.2 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对CyclinE和cdk2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

4.统 计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK－q检验，检验水准α为0.05。对眼睑基底细胞癌及癌旁组织的CyclinE和cdk2表达的阳性面积率作双变量相关分析，检验水准α为0.05。

结 果

1.CyclinE的表达

基底细胞癌组织中可见癌细胞胞浆内有密集分布的棕黄色颗粒，CyclinE表达强（图1）；癌旁组织的细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，CyclinE表达弱（图2）。图像分析结果经q检验，眼睑基底细胞癌与癌旁组织之间，CyclinE的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05﹚见表1。

表1 基底细胞癌与癌旁组织CyclinE表达的平均光密度和阳性面积率（¯x±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of CyclinE in eyelid basal cell carcinoma and cancer side tissue（¯x±s）

图1 CyclinE的表达 基底细胞癌组织中可见癌细胞胞浆内有密集分布的棕黄色颗粒，CyclinE表达强（SP×200）；图2 CyclinE的表达 癌旁组织的细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，CyclinE表达弱（SP×200）；图3 cdk2的表达 基底细胞癌组织中可见癌细胞胞浆内有密集分布的棕黄色颗粒，cdk2表达强（SP×200）；图4 cdk2的表达 癌旁组织的细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，cdk2表达弱（SP×200）。Fig.1The expression of CyclinE in eyelid basal cell carcinoma .There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed CyclinE expressed strongly.S-P×200Fig.2The expression of CyclinE in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm ，which showed CyclinE expressed weakly.S-P×200Fig.3The expression of cdk2in eyelid basal cell carcinoma.There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed cdk2expressed strongly.S-P×200Fig.4The expression of cdk2in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm ，which showed cdk2 expressed weakly.S-P×200

2.cdk2的表达

基底细胞癌组织中可见癌细胞胞浆内有密集分布的棕黄色颗粒，cdk2表达强（图3）；癌旁组织的细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，cdk2表达弱（图4）。图像分析结果经q检验，眼睑基底细胞癌与癌旁组织之间，cdk2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05﹚见表2。

表2 基底细胞癌与癌旁组织cdk2表达的平均光密度和阳性面积率（¯x±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of CyclinE in eyelid basal cell carcinoma and cancer side tissue（¯x±s）

讨 论

基底细胞癌是眼睑最常见恶性肿瘤，约占眼睑恶性上皮性肿瘤的85%-95%。通常发生于暴露日光的皮肤上，男性略多，眼睑基底细胞癌是生长缓慢且无疼痛的肿瘤，病程一般较长，最长可达20年。BCC（basal cell carcinoma）一般只局部侵袭，很少转移，但若不及时治疗，肿瘤可侵及眼轮匝肌、睑板和眶骨，并可经眼眶向颅内侵犯［4－5］。近年来随着人口的高龄化，眼睑基底细胞癌有逐渐增多的趋势［6－7］。如能从分子水平更快更准确地对BBC进行早期诊断，则能最大限度的提高患者的生产率。

细胞周期是细胞物质积累和细胞分裂的循环过程，其有序进行受到严密的调节和控制。细胞周期的调控主要依赖于由各种细胞周期蛋白（cyclin）和相应的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent-kinase，CDK）组成的蛋白激酶复合物来完成，其中CyclinE-CDK2在G1／S期的转折中起着重要作用［8－9］。

近年来，随着细胞周期调控机制的阐明，细胞周期调控因子在恶性肿瘤发病机制中的作用受到人们重视。研究已表明绝大多数肿瘤细胞都存在着若干细胞周期调控基因的改变。cyclinE和cdk2是细胞周期中重要调控因子，主要作用于G1期和S期，是DNA复制的重要启动因子。正常情况下，cyclinE合成出现在G1中期，S初期含量最高而后逐渐降解消失，但在肿瘤细胞中其表达可见于整个细胞周期；cdk2的表达水平在整个细胞周期中保持不变。两者异常表达将驱使细胞超越G1／S期限制点而导致细胞周期缩短、细胞增殖增加［11－13］。cyclin E 和cdk2表达异常与乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等肿瘤的发生发展有密切关系［14－16］，但对于两者在眼睑基底细胞癌中发病机制中的作用目前了解甚少。

我们的实验结果显示：20例眼睑基底细胞癌组织中cyclin E和cdk2表达水平明显高于癌旁组织，差异有显著性（P＜0.05），实验结果表明cyclin E和cdk2的过度表达可促进肿瘤细胞过度增殖，导致肿瘤的形成，其作用机制推测：真核细胞的分裂必须通过G1-S期转换开始进行DNA合成，通过G2-M期转换进入有丝分裂期，其中CyclinE与G1期密切相关，CyclinE可与CDK2结合形成复合体，随着CDK活化激酶活化而被激活，激活的复合体与CyclinE／CDK2复合体一起使Rb磷酸化，释放出转录因子E2F，驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖。CyclinE的过表达可导致pRb蛋白的磷酸化修饰提前实现，并加速细胞从G1-S期转变过程。当CyclinE占优势与CDK2结合时，过度刺激细胞分裂，使细胞呈失控性生长，而形成肿瘤。提示cyclinE／cdk2复合物参与眼睑基底细胞癌的发生过程，cdk2还可能通过其它机制影响眼睑基底细胞癌的发生发展，其确切机制有待进一步探讨。

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