NF-κB、IκB、IKK在非小细胞肺癌中的表达及意义

赵 统 吕坤聚 蒋捍东

（中国人民解放军第401医院呼吸内科； 1青岛大学医学院附属医院呼吸内科，山东266000）

肺癌在上世纪50年代还被视为罕见的恶性肿瘤，现今估计每年210多万人确诊肺癌，110万人死于肺癌［1］。尽管目前手术及放化疗发展迅速，但肺癌患者的总体生存率仍低于15%，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占到80%［2］，对于这一疾病急需深入的研究。近来研究表明，IKKβ／IκB／NF-κB 信号通路在NSCLC细胞中处于持续激活状态，并通过调节基因转录参与NSCLC的发生、发展［3］。本研究应用免疫组化的方法检测 NF－κB P65、p-IκBα、p-IKKβ在NSCLC组织及癌旁组织中的表达情况，探讨三者与NSCLC临床病理特征的关系。

材料和方法

1.标 本与资料

收集2009年10月-2010年10月解放军第四零一医院胸外科手术标本56例NSCLC（排除以下患者1、手术之前进行过放疗或（和）化疗者，2、合并有肺癌以外的其他肿瘤者，3、组织块石蜡包埋不充分者。）其中鳞癌30例，腺癌26例。男性38例，女性18例；最大年龄75岁，最小年龄39岁，平均年龄55.1岁。随机选择20例NSCLC癌旁组织。将标本用10%中性甲醛溶液固定，脱水、透明、石蜡包埋。组织病理分类及分级由我院病理科医生确定，结合手术、影像学检查（每位病人均有胸部CT、颅脑MRI（或CT）、骨素描、腹部B超或全身PET-CT检查）进行TNM分期。

2.方 法和试剂

石蜡包埋的组织块经5μm厚连续切片，分别做HE染色和免疫组织化学染色。免疫组化染色采用Elivision法。步骤如下：脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原、自然冷却至室温、3%过氧化氢溶液封闭、加一抗（稀释比例1：200）后4℃过夜、37℃复温、加二抗37℃反应、DAB显色、苏木素复色、盐酸酒精分化、脱水透明、中型树胶封片。用PBS液取代一抗做空白对照。兔抗人p-IKKβ（磷酸化IKKβ）单克隆抗体、兔抗人p-IκBα（磷酸化IκBα）单克隆抗体、兔抗人NF－κB P65单克隆抗体均购自博世德生物技术有限公司。显色试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。

3.结 果判断

NF-κB P65的表达主要位于胞核及胞浆中有黄色颗粒，p-IκBα、p-IKKβ的表达主要位于胞浆中有黄色颗粒，少数胞核内亦可有表达。染色强度计分：通过显微镜观察，0分为阴性；1分为弱阳性，染色为淡黄色；2分为阳性，染色为黄色；3分为强阳性，染色为棕褐色。着色细胞百分率计分：评定每张切片10个高倍视野计数着色细胞百分比：阳性细胞≤5%为0分，6%－25%为1分，26%－50%为2分，51%－75%为3分，＞76%为4分。以阳性细胞百分率记分和强度记分相乘所得总分进行判断，总分0分为阴性，1-4分为（＋），5-8分为（＋＋），9-12分为（＋＋＋）。

4.统 计学处理

统计学分析采用SPSS 17.0软件系统进行分析，实验组与对照组，实验组内分级比较采用χ2检验。P＜0.05表示有统计学意义。

结 果

1.N F-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ在 NSCLC组织中及癌旁组织中的表达

NF-κB P65蛋白的阳性表达主要定位在胞核及胞浆（图1），p-IκBα、p-IKKβ蛋白的阳性主要定于胞浆（图2、3），三者在NSCLC中阳性率分别为83.9%（47／56）、55.7%（31／56）69.6%（39／56），癌旁组织阳性率分别为20% （4／20）、25% （5／20）、30%（6／20）。NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ在 NSCLC中的阳性率均高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.N F-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ表达与 NSCLC临床病理间的关系

在 NSCLC组织中 NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白的表达与患者的年龄、性别、组织类型无相关性（P＞0.05），但与 NSCLC的吸烟史、TNM 分期、淋巴结转移显著相关（P＜0.05）（表2）。

表1 NF－κB P65、IκBα、IKKβ在 NSCLC和癌旁组织的表达Table 1 Association of NF-κB P65、IκBα、IKKβstaining status in case，adjucent tissues

表2 NF－κB P65、IκBα、IKKβ表达与 NSCLC临床病理特征的关系Table 2 The relationship between NF-κB P65、IκBα、IKKβexpressions in NSCLC and pathological characteristics factors

图1 NF－κB P65在肺癌中呈阳性，×400倍。 Fig.1NF-κB P65strong expression in case，×400图2 p-IκBα在肺癌中呈阳性，×400倍。 Fig.2p-IκBαPositive expression in case，×400图3 p-IKKβ在肺癌中呈阳性，×400倍。 Fig.3p-IKKβstrong expression in case，×400

3.NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ之间相关性

本实验研究发现 NF-κB P65和p-IκBα共表达22例，共阴性10例，p-IκBα和 p-IKKβ共表达19例，共阴性15例，两组数据经 McNemarχ2分析，P＜0.05，故 NF－κB P65和p-IκBα，p-IκBα和p-IKKβ存在正相关。

讨 论

1986年，Sen和Baltimore首次从B细胞提取物中检测到一种可与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子，称之为核因子κB［4］。近年来研究发现，IKK／IκB／NF-κB信号通路与多种恶性肿瘤发生发展有关，例如胰腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌［5－8］。Tang等用免疫组化的方法观察肺癌组织中NF-κB P65表达，发现肺癌组织中NF-κB P65表达明显高于正常肺组织［9］。Jin等采用凝胶蛋白电泳及免疫组化法发现肺癌组织中NF－κB P65核内表达及p-IκBα、p-IKKβ胞浆内表达高于癌旁组织［10］。本研究结果显示在NSCLC组织中NF-κB P65核内表达及p-IκBα、p-IKKβ胞浆内表达明显高于癌旁组织，两者存在明显的统计学差异，与上述研究结果相似。在本次试验中发现，在吸烟组、TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期组以及转移组中NF－κB P65核内表达及p-IκBα、p-IKKβ胞浆内表达明显高于非吸烟组、TNM分期为Ⅰ、Ⅱ期组以及无转移组。Zhang等报道称肺癌组织中NF－κB高表达提示组织分化更差，更高恶性程度［11］。也曾有报道发现NF-κB P65、p-IκB在 NSCLC高表达，提示 NSCLC患者生存率降低［12］。上述研究与作者结果相似。作者发现 NF－κB P65和 p-IκBα，p-IκBα和 p-IKKβ存在正相关。与此前研究一致：NF-κB通常在胞浆中与IκB结合为无活性的化合物。当Ikk被激活，进一步将IκB磷酸化，而使 NF-κB／IκB发生解离，NF-κB进入胞核内，与相应位点结合，发挥生物学效应［13－14］。以上研究表明：IKK／IκB／NF-κB 信号通路在NSCLC的发生、发展、转移起着重要作用。

IKK／IκB／NF-κB信号通路在 NSCLC 发生发展中的重要作用不言而喻，然而其在NSCLC中活化及作用机制尚不明确，有研究显示：由于受NF－κB转录激活的基因多达上百种，其中包括炎性因子、黏附分子、化学趋化因子、基质金属蛋白酶，以及多种增殖和凋亡相关基因。NF-κB活性增强，进而使上述基因表达增加，后者促进细胞的恶性转化和转移［15］。因此采用抑制 NF－κB蛋白活化，阻止其下游基因激活的方法，NF-κB可能成为肿瘤治疗中新的靶基因。

总之，IKK／IκB／NF-κB信号通路在 NSCLC的发生、发展中起着重要作用，充分了解该通路可为NSCLC的诊断治疗提供新的方法。

［1］Jemal A，Thomas A，Murray T，et al.Cancer staistics.CA Cancer J Clin，2002，52（1）：23-47

［2］Toloza EM，D＇Amico TA.Targeted therapy for non-small cell lung cancer.Semin Thorac Cardiovasc Surg，2005，17（3）：199-204

［3］Tang X，Liu D，Shishodia S，et al.Nuclear factor kappa B（NF-κB）is frequently expreese in lung cancer and preneoplastic lesions.Cancer，2006，107（11）：2637-2646

［4］Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enchancer sequences.Cell，1986，46（5）：705-716

［5］Ross JS，Kallakury BV，Sheehan CE，et al.Expression of nuclear factor-kappa B and I kappa B alpha prostatic adenocarcinomas：correlation of nulear factor-kappa B immunoreactivity with disease recurrence.Clin cancer res，2004，10（7）：2466-2472

［6］Sasaki N，Morisaki T，Hashizume K，et al.Nuclear factor-kappa B p65（Rel A）transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue.Clin Cancer Res，2001，12（7）：4136-4142

［7］Stathopoulos GT，Zhu Z，Everhart MB，et al.Nuclear factor-kappa B affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion.Am J R Espir Cell Mol Biol，2006，34（2）：142-150

［8］El-Rayes BF，Ali S，Ali IF，et al.Potentiation of the effect of erlotinib by genistein in pancreatic cancer：the role of Akt and nuclear factor-κB.Cancer Res，2006，66（21）：10553-10559

［9］Tang X，Liu D，shiahodia S，et al.Nuclear factor-kappaB（NF-kappaB）is frequently expressed in lung cancer and preneeoplastic lesions.Cancer，2006，（11），107：2637-2646

［10］Jin Xq，Wang Zm，Qiu L，et al.Potential biomarkers involxing IKK／ RelA signal in early stage non-small cell lung cancer.Cancer Sci，2008，99（3）：582-589

［11］Zhang Z，Ma J，Li N，et al.Expression of nuclear factor-kappaB and its clinical significance in nonsmall-cell lung cancer.Ann Thorac Surg，2006，82（1）：243-248

［12］Zhang Dl，Jin Xq，Wang L，et al.Combined Prognostic Value of Both RelA and IκB-αExpression in Human Non-Small Cell Lung Cancer.Ann surg oncol，2007，14（12）：3581-2592

［13］Hoffmann A，Levchenko A，Scott ML，et al.The IκBNF-κB Signaling Module：Temporal control and selective Gene Activation.Science，2002，5596（298）：1241-1245

［14］May MJ，dacquisto F，Madge LA，et al.Selective Inhibition of NF-κB Activation by a Peptide That Blocks the Interaction of NEMO with the IκB kinase complex.Science，2002，4584（289）：1550-1554

［15］Yamamoto Y，Gaynor RB.Therapeutic potential of inhibition of the NF-κB pathway in the treatment of inflammation and cancer.J Clin Invest，2001，107（2）：135-142