GFP转基因裸鼠脾脏组织学观察

方 天，尤金炜，张立波，陈 涛，田小芸，刘 彪，吴正林，许龙祥，周森妹，赵志刚，恽时锋

（1.南京军区南京总医院比较医学科，全军实验动物科普与伦理教育基地，全国科普教育基地，南京 210002； 2.江苏省金坛市金城镇畜牧兽医站，金坛 213200）

BALB/c裸小鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠，目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。特别是在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面，它有着特殊的价值［1］。目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，我国所应用的自发性免疫缺陷小鼠，主要应用的是BALB/c遗传背景的裸鼠。

BALB/c荧光裸鼠是将GFP基因导入BALB/cnu/nu小鼠而得。来源于水母（aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。荧光成像具有简单操作、所得结果直观、灵敏度高等特点，在活体动物体内成像中可得到广泛应用［2-5］。GFP转基因裸鼠因自身含有标记蛋白与普通裸鼠相比而具有明显的优势，但在饲养以及繁殖过程中发现，荧光裸鼠繁殖率低、存活率、免疫力低下，更难获得适宜于实验的荧光裸鼠。这一现象与外源GFP基因对小鼠发育存在一定毒性的报道不谋而合［6］。本实验所选用的荧光裸鼠均为本科室工作人员通过多年杂交选育工作取得，选育方法：选择自带GFP转基因的C57BL/6小鼠与BALB/c裸鼠杂交，并与BALB/c裸鼠回交并经逐代选育，选育至第六代，产生了GFP基因表达较为稳定的BALB/c绿色荧光裸鼠。C57BL/6中插入的GFP绿色荧光蛋白基因序列号为：GenBank L29345.1，同时转入鸡β-actin启动子序列；原始导入的外源基因：包括GFP基因，和控制其表达的promoter（chicken beta-actin promoter），同时转入巨细胞病毒的增强子，增强GFP基因表达。本实验应用这两种动物模型，观察荧光裸鼠随日龄增长脾脏组织学变化与否，并探讨GFP基因的导入对裸鼠的脾脏发育、组织学形态以及功能是否有影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组与饲养

实验动物采用SPF级不同日龄（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）BALB/c荧光裸鼠32只，每个特定日龄阶段取8只，雌雄各半；以及不同日龄（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）BALB/c普通裸鼠32只，每个日龄阶段取8只，雌雄各半。BALB/c荧光裸鼠和BALB/c普通裸鼠均由本科室工作人员选育，本科室实验动物使用许可证编号：SYXK（军） 2007—029；实验动物生产许可证编号：SCXK（军） 2007—012。

1.2 实验方法与研究指标

1.2.1 脾脏绝对重量和脾脏指数的测定

每组动物按在实验设计中的日龄处死，称重，无菌条件下取出脾脏称重。用小鼠脾脏的重量除以各自体重，求相对湿重即为脾脏指数，以mg/g表示。

1.2.2 光镜观察

脾脏组织经常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色。光镜下观察脾脏组织形态差异。计算并比较各组切片淋巴细胞数：用目镜测微尺为标线，以脾中央小动脉为中点，分别计算压在标线上两边的淋巴细胞数，求均数为一个中央小动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞数，按同样方法计算3个脾中央小动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞数，取均数即为脾中央小动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞数［11］。

1.2.3 荧光显微镜下观察

28日龄荧光裸鼠的脾脏取出后制作成冰冻切片用荧光显微镜在480 nm激发光下进行观察；14日龄、28日龄、49日龄、70日龄荧光裸鼠无菌条件下取出脾脏后立即用荧光显微镜在480 nm激发光下进行观察。

1.3 统计学处理

数据以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计学软件包分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果

荧光裸鼠与普通裸鼠体重、脾脏绝对重量和脾脏指数经方差分析发现，同一日龄荧光裸鼠与裸鼠之间体重、脾脏绝对重量和脾脏指数差异无统计学意义。荧光裸鼠组各日龄阶段比较结果如下：与14日龄组荧光裸鼠比较，28日龄组体重、脾脏绝对重量和脾脏指数明显增大（P＜0.05）；49日龄组体重、脾脏绝对重量明显增大（P＜0.05），但脾脏指数差异不显著；70日龄组体重、脾脏绝对重量明显增大（P＜0.05），脾脏指数差异也不显著（表1）。

各日龄阶段脾脏切片HE染色结果：在光学显微镜下观察普通裸鼠脾脏结构清晰明显，白髓与红髓界限较明显，脾小结、中央动脉和动脉周围淋巴鞘清晰可见，淋巴细胞密集。同一日龄阶段的荧光裸鼠与普通裸鼠相比，14日龄、28日龄、49日龄、70日龄荧光裸鼠脾脏淋巴细胞数较少，淋巴细胞密度稀疏；并含有更多脾小动脉（彩插1图1）。荧光裸鼠各组别间进行比较结果是：与14日龄荧光裸鼠相比，49日龄、70日龄荧光裸鼠淋巴细胞数较少、淋巴细胞密度较低（彩插1图1、图2、表2）。

表1 荧光裸鼠脾脏绝对重量和脾脏指数Tab.1 The weight of spleen and the spleen index in nude mice with GFP

表2 荧光裸鼠、普通裸鼠脾脏淋巴细胞数Tab.2 The sum of lymphocyte cells in nudemice with GFP and nude m ice

28日龄荧光裸鼠脾脏冷冻切片观察结果：被膜厚，绿色荧光蛋白表达明显，荧光光线亮、荧光强度强，白髓结构多而典型且荧光亮度更亮，红髓结构荧光强度稀疏，移行区明显（彩插2图3）。14日龄、28日龄、49日龄、70日龄荧光裸鼠脾脏实体观察结果：脾脏内绿色荧光蛋白（GFP）表达持续稳定，且表达量较多；其中心荧光强度最大，并呈散射状向四周扩散（彩插2图4）。

3 讨论

脾脏由白髓、边缘区和红髓组成，在机体的免疫应答过程中起到了重要作用。白髓是淋巴细胞密集的区域，由脾小体和动脉周鞘组成，其中脾小体是B淋巴细胞密集的区域，机体免疫功能活跃时，脾小体中可出现生发中心，动脉周鞘是T淋巴细胞密集的区域。边缘区是白髓向红髓移行的区域，含有大量的巨噬细胞和一些T、B细胞，以B细胞较多。边缘区最先接受抗原刺激并发生免疫应答的场所［7-9］。当机体受到抗原刺激时，抗原经巨噬细胞加工处理后，在T细胞的协同作用下，脾小体的B淋巴细胞增殖产生大量的效应B细胞，B细胞可分化为浆细胞分泌抗体，参与体液免疫［10-11］。本实验中，28日龄荧光裸鼠脾脏指数明显高于14日龄荧光裸鼠、49日龄荧光裸鼠和70日龄荧光裸鼠（p＜0.05，表1），这表明脾脏在14日龄到28日龄之间生长发育速度快，而28日龄后则基本停止脾脏个体发育；反映脾脏生长发育的变化趋势。

14日龄荧光裸鼠脾脏白髓较少，其淋巴细胞密度不高，并且移行区不明显（彩插1图1a）；28日龄荧光裸鼠的白髓结构多而典型，淋巴细胞密度较大，移行区明显（彩插2图3）；49日龄和70日龄荧光裸鼠的白髓结构有的不规则，有的较松散或仅有少量淋巴细胞组成，移行区不明显，红髓区淋巴细胞索结构突出（彩插1图2e；图2g）。脾脏作为机体接受抗原刺激后产生免疫反应的场所，其组织学变化反映了机体免疫功能的改变。白髓结构典型与否和机体受到的抗原刺激有关，随增龄，机体受到的抗原刺激增多，免疫应答能力增强，脾小结内含分化活跃的B细胞，移行区作为脾脏-血液淋巴细胞再循环的通道，可及时动员有免疫活性的淋巴细胞发挥作用［12］。

脾脏是机体内最大的外周免疫器官［13］，脾脏淋巴细胞数量多少可在一定程度上反映机体免疫功能的高低［14-15］。与普通裸鼠相比，同一日龄荧光裸鼠脾脏淋巴细胞数较少、淋巴细胞密度稀疏（P＜0.05）；荧光裸鼠不同日龄组之间比较结果，28日龄之后，随日龄增长，淋巴细胞数呈减小趋势（P＜0.05）（表2）。这从一定程度上说明：荧光裸鼠与同一日龄的普通裸鼠相比较，免疫功能更为低下；并且荧光裸鼠随日龄增长，免疫功能有下降趋势。荧光裸鼠持续高表达绿色荧光蛋白（GFP，彩插2图4）。本实验结果反映外源基因GFP基因会对脾脏形态及其功能产生一定的影响。关于外源导入基因如何影响荧光裸鼠脾脏形态及其功能的机制尚需进一步研究。

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