耐头孢菌株的糖尿病肾病临床特点的研究

周小年 蓝文 覃志伟 李红斌

耐头孢菌株的糖尿病肾病临床特点的研究

周小年 蓝文 覃志伟 李红斌

目的 研究耐头孢他啶的糖尿病肾病患者对β-内酰胺酶(EsBIJs)携带情况及对常用抗菌药物的耐药情况。方法 筛选出耐头孢他啶的菌株，PCR扩增基因TEM、SHV、CTX-M。进而进行对头孢他啶、庆大霉素、环丙杀星、头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南的药敏性检验。结果 有89%糖尿病肾病患者出现耐头孢他啶的情况，在耐头孢他啶菌株中有68%表现产ESBLs阳性菌对头孢类抗生素高度耐药，对庆大霉素、环丙杀星的耐药率为69% ～88%，对头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦耐药率为20%～30%，对亚胺培南高度敏感(100%)。结论 耐头孢他啶的糖尿病肾病患者易携带β-内酰胺酶基因，并表现多重耐药性。

糖尿病肾病;头孢菌素;ESBLs;亚胺培南

糖尿病及其慢性并发症已严重影响人类健康和生活质量。近年来，糖尿病发病人数呈上升趋势。糖尿病肾病(DN)是糖尿病的重要并发症之一，已成为导致终末期肾衰竭的首位疾病［1］。在糖尿病肾病的临床治疗中，第3代头孢菌素的使用呈逐年上升的趋势，这是由于第3代头孢菌素类药物对β-内酰胺酶高度稳定，血浆消除半衰期内分布广，组织穿透力强，对肾脏基本无毒性，且制剂类多，选择种类较多，适合各年龄段患者，始终是应用中的首选［2］。随着三代头孢菌素的广泛应用，糖尿病肾病患者易发生产ESBIJs菌的耐药问题，所以临床分离产ESBIJs细菌对指导临床合理应用抗生素、抑制新产生的耐药菌等均有十分重要的意义［3］。本实验针对头孢菌素类药物耐药的DN患者进行观察，分析耐药机制，同时探讨其临床特点，并提出合理的治疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取1年以上使用第三代头孢菌素的300位糖尿病肾病患者为研究对象，收集患者血液和尿液，放在水解酪蛋白胨(M-H)琼脂培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司。然后挑取菌落，制备菌株。

1.2 抗生素纸片 头孢他啶、庆大霉素、环丙沙星、头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 耐头孢他啶的药敏实验 将从患者体内分离的菌株，用抗菌药物纸片扩散法即K-B法和MIC法测定对头孢他啶的药敏情况。将菌株对头孢他啶抑菌环直径≤15 mm或MIC≥6μg/ml的菌株，归为不敏感菌株。

1.4 ESBIJs筛选试验 双纸片协同实验，参照NCCLS(2009年版)，按常规纸片扩散法在M-H上涂好菌株。先在平板中心贴阿莫西林纸片，然后在其上下左右贴CAZ、ATM、FTX、FEP，周围纸片距中心纸片距离25 mm，35℃孵育18～20 h。如周围4个药敏中有任何一个与阿莫西林有协同作用为ESBIJs阳性菌株。

TEM基因PCR反应参数为94℃预变性5min，然后94℃lmin，55℃ 1 min，72℃ l min，30 个循环，再 72℃10 min。SHV基因PCR反应参数为94℃预变性5 min，94℃ 30 s，退火 68℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30 个循环，再72℃10 min。CTX一M基因PCR反应参数为94℃预变性3 min，然而94℃ 45 s，56℃45 s、72℃1 min，32 个循环，再 72℃ 5 min。PCR 产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察结果。

1.6 对常用抗菌药物的耐药情况 对表型为ESBIJs阳性菌株，分别进行对常见药物亚胺培南、庆大霉素、环丙沙星、头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦的药敏试验，方法如同耐头孢他啶的药敏实验。

1.7 仪器FQD-33A荧光定量PCR检测系统购自杭州博白公司。

2 实验结果

2.1 耐头孢他啶菌株阳性率 用抗菌药物纸片扩散法即KB法和MIC法测定从患者体内分离的菌株对头孢他啶的药敏情况。发现在300例患者中有267例，即89%的DN患者均对头孢他啶耐药。

表1 患者耐头孢他啶菌株阳性率(例，%)

2.2 TEM、SHV、CTX一M基因PCR检测结果 在267例耐头孢他啶的DN患者，进行产ESBIJs阳性菌的筛选。为了进一步的确认产ESBIJs阳性菌。用PCR扩增ESBIJs酶中常见的3种TEM、SHV、CTX-M 基因，TEM和SHV基因扩增均出现相同条带(1 074 bp)，CTX一M基因出现217 bp清晰明亮产物带。发现TEM、SHV、CTX-M基因的检出率分别为52.3%、43.3%和68.7%。有72株菌株同时检测到2种以上基因型。见图1～3。

图1 TEM基因1074 bp片段琼脂凝胶电泳图

图2 SHV基因1074 bp片段琼脂凝胶电泳图

图3 CTX-M基因217 bp片段琼脂凝胶电泳图

2.3 药敏试验结果 由表2的实验结果得出，产ESBIJs菌对头孢类抗生素高度耐药，对庆大霉素、环丙杀星的耐药率为69% ～88%，对头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦耐药率为20% ～30%，对亚胺培南高度敏感(100%)，产ESBIJs菌表现出多重耐药性，除了对亚胺培南的耐药率很低以外，对其常见的抗生素均表现耐药交叉性。

表2 产ESBIJs菌对常见抗生素的耐药率(例，%)

3 讨论

糖尿病肾病DN是糖尿病严重的慢性并发症，DN的发病是多因素综合作用的结果。近年来，由于广谱头孢菌素在糖尿病肾病临床治疗中的广泛应用，患者对头孢菌素的耐药率有增加的趋势。如何合理使用抗菌药物，尽可能减少抗菌药物的毒副作用，减少二重感染及细菌耐药性的发生，一直备受广大临床工作者的关注。据相关文献报道［4］，超广谱β-内酰胺酶(EsBIJs)，能水解包括三代头孢菌素、单环酰酶胺类抗生素和四代头孢菌素等含1个氧亚氨基基团侧链的β-内酰胺(0xyimino B-lactam)类抗生素，但可被β-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸)等抑制。所以本实验首先筛选出耐头孢他啶的DN患者。发现在300例患者中有267例，即89%的DN患者均对头孢他啶耐药。

ESBIJs耐药基因种类较多，包括TEM型、SHV型、CTXM型等，其中以TEM和SHV型为主，但在中国以CTX-M型为主。本实验对筛选出的耐头孢他啶的患者进行ESBIJs表型及其基因分析。通过ESBIJs筛选试验，发现267例患者中，有187例，即70%的患者表现ESBIJs阳性特征。然后通过PCR扩增TEM、SHV、CTX一M基因，进一步确认产ESBIJs的阳性患者［5］。发现 TEM、SHV、CTX-M 基因的检出率分别为52.3%、43.3%和68.7%。有72株菌株同时检测到2种以上基因型。见图1～3。

然后对ESBIJs表型阳性的菌株进行其他常见抗菌药物的药敏检验。由实验结果得出，产ESBIJs菌对头孢类抗生素高度耐药对庆大霉素、环丙杀星的耐药率为69%-88%，对头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦耐药率为20%-30%，对亚胺培南高度敏感(100%)，产ESBIJs菌表现出多重耐药性，除了对亚胺培南的耐药率很低以外，对其常见的抗生素均表现耐药交叉性。因为ESBIJs常位于质粒上，可以从一个细菌传递到另一个细菌，甚至在不同的菌种之间传递［6］。因此，产ESBIJs细菌的耐药性与携带多个耐药基因的质粒、ESBIJs基因型及细菌本身固有的耐药机制有关。产ESBIJs细菌常表现出对多种抗菌药物的同时耐药，常同时对第三代头孢菌素，喹诺酮类及氨基糖苷类药物耐药。而碳青霉烯类抗生素，包括亚胺培南、美洛培南等，在体内与体外对ESBIJs都高度稳定，是治疗产ESBIJs菌株严重感染疗效确切的一类药物［7］。喹诺酮类药物耐药基因常位于染色体上，最近研究显示喹诺酮类药物耐药基因和ESBIJs编码基因可位于同一个可转移性的质粒上。产ESBIJs细菌的质粒上还往往连锁携带了耐氯霉素、磺胺类、四环素、氨基糖苷类等的耐药基因［8］。

如何合理使用抗菌药物，尽可能减少抗菌药物的毒副作用，减少二重感染及细菌耐药性的发生，一直备受广大临床工作者的关注［9］。随着三代头孢菌素的广泛应用，产ESBIJs菌引起的耐药问题越来越严重，对临床分离产ESBIJs细菌的监测成为临床微生物检验十分重要的内容，对指导临床合理应用抗生素、有效治疗革兰阴性菌引起的严重感染性。疾病、医院内感染的控制、抑制新产生的耐药菌等均有十分重要的意义。

［1］舒士敏，徐丽，张玉璞，李宜，张英泽.糖尿病肾病治疗近况.实用糖尿病杂志，2005，13(05):53-54.

［2］孙惠娟，张卫同，陈海滨.头孢菌类抗生素应用分析.中国现代医学杂志，2006，16(13):2059-2061.

［3］邵剑春，胡大春，杨绍敏，周玲，李超，刘德华.产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及其基因分析.国外医学(临床生物化学与检验分册)，2005，26(12):872-876.

［4］管希周，刘又宁，王睿.临床产ESBIJs细菌耐药特性及其基因分型的研究.中国抗生素杂志，2001，26(6):468-472.

［5］梁陈方，蒋利君，韦晓谋.第三代头孢菌素的用药频度与耐药现状分析.中国药物与临床，2005，5(03):192-194

［6］彭少华，吴琼，聂署萍.耐亚胺培南铜绿假单胞菌产OXA型β内酰胺酶分型.中国感染与化疗杂志，2007，7(04):295-298.

［7］朱卫民，钱元恕.β-内酰胺酶动力学研究进展及临床意义.国外医药(抗生素分册)，1998，10(06):445-451.

［8］Deinum J，Tarnow L，Van Gool JM，etal.Plasma renin and prorenin and rennin gene variation in patientswith insulin dependent diabetesmellitus and nephropathy Neprhrol Dial Transplant，1999，14:1904-1911.

［9］Solini A，Vestra MD，Saller A，The angiotensin converting enzyme DD genotype is associated with glomerulopathy lesions in type2 diatetes Diatetes，2002，51:251-255.

415000 湖南省常德市石门县人民医院