熟地中水溶性多糖超声提取工艺的正交优化

林春燕，暴 珑，黄家园，李 淳，姜汉石，李文德，吴天秀

(1.广东医学院生理科学教研室，广东湛江524023;2.广东医学院第一临床学院，广东湛江524023;3.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江524023;4.广东医学院解剖教研室，广东湛江524023)

熟地为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的炮制加工品，有补肾阳，生精血之功效。药理实验表明，熟地多糖具有免疫和抑制肿瘤活性，并对心血管系统有强心、降压、保护心肌、抑制血栓形成和降血脂等作用［1，2］，根据其水中的溶解度可分为水溶性和水不溶性两类。目前有关熟地黄水溶性多糖提取的报道多是采用粗放的直接加热法，关于超声波提取熟地黄多糖工艺优化的报道却很少见。超声波是频率高于20 kHz，并且不引起听觉的弹性波。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响［3］。本实验拟采用超声波强化提取熟地黄中的水溶性多糖，利用正交实验法研究不同提取因素对熟地黄水溶性多糖提取效果的影响，并对提取工艺条件进行优化。

1 材料与仪器

1.1 材料 熟地原料为市售熟地黄饮片，干燥，粉碎过40目筛，备用。

1.2 仪器与试剂 UV－752分光光度计(上海分析仪器厂)，电热鼓风干燥箱(上海跃进医疗有限公司工厂)，RE－

2 方法

2.1 水溶性多糖的提取与精制 称取熟地干粉10 g，按一定料液比加水浸泡30 min，按一定的提取时间、提取温度和提取次数进行超声提取，提取液冷却后抽滤，再用漏斗过滤，合并提取液，用旋转蒸发器减压浓缩至约50 mL，加入无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，得精制多糖，真空干燥后称重，计算多糖得率。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 葡萄糖标准溶液的配制 精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.1 mg，溶解并定容至100 mL容量瓶，即得葡萄糖标准储备液，其浓度为0.101 mg·mL－1。

2.2.2 6%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏。收集182℃馏分，称取12 g加蒸馏水190 g溶解，即得6%的苯酚溶液，置于棕色瓶中备用。

2.2.3 标准曲线的制备 用移液管分别吸取葡萄糖贮备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0 mL分别置于20 mL的比色管中，加蒸馏水至1 mL，另取1.0 mL蒸馏水做空白对照。分别加入6%的苯酚溶液0.5 mL，摇匀，迅速滴加2.5 mL浓硫酸充分摇匀，室温放置30 min，于紫外分光光度计490 nm波长处测定吸光度值，同样条件下以蒸馏水为空白对照。以浓度(C)对吸光度(A)，进行线性回归，求得回归方程A= 0.008 7C+0.005 6，r=0.999 7。

2.2.4 样品含量测定 精确吸取样品液(精密称取60℃干燥至恒重的熟地黄多糖0.100 g，置100 mL容量瓶中，加入少量蒸馏水溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL)，按标准曲线制备项下方法测定其吸收度值，按下式计算多糖含量，多糖含量(%)=CDf/W×100(C为样品溶液的葡萄糖的质量，D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因素)。

2.3 水溶性多糖提取工艺优化

2.3.1 单因素实验 准确称取10 g熟地样品，以水为提取溶剂，改变提取时间、提取温度、料液比和提取次数等因素，以多糖得率为考察指标，进行单因素实验。

2.3.2 正交实验 根据单因素实验结果，选取料液比、提取时间、提取温度和提取次数为主要考察因素，以多糖得率及多糖含量作为考察指标，试验采用综合加权评分法［4］，权重系数均为0.5。分别把试验项中最大的指标定为100分，其他各号按下式评分:综合评分=(各实验组多糖得率/多糖得率最大值)×100×0.5+(各实验组多糖含量/多糖含量最大值)×100×0.5。采用L9(34)正交表进行实验。因素水平见表1。

3 结果

3.1 单因素实验结果

3.1.1 提取时间的影响 以蒸馏水为提取溶剂，料液比为1∶20，提取温度为60℃，提取1次，提取时间为0～90 min时，多糖的提取效率随着时间的延长有较大的提高，超过150 min有降低的趋势，结果见图1。

表1 因素水平表

图1 提取时间对提取效果的影响

3.1.2 料液比的影响 以蒸馏水为提取溶剂，提取时间为60 min，提取温度为60℃，提取1次，随着料液比的增大，多糖得率也逐渐增大。但料液比达到1∶20时，增加提取溶剂，无法增加多糖得率，结果见图2。

图2 料液比对提取效果的影响

3.1.3 提取温度的影响 以蒸馏水为提取溶剂，料液比为1∶20，提取时间为60 min，提取1次，提取温度为60℃时，多糖得率最高，超过60℃多糖含量逐渐下降，结果见图3。

图3 温度对提取效果的影响

3.1.4 提取次数的影响 以蒸馏水为提取溶剂，料液比为1∶20，提取时间为60 min，提取温度为60℃ 时，多糖的得率随着提取次数的增加而增大，从节省时间提高效率等方面考虑，提取次数控制在3次以内比较合适，结果见图4。

图4 提取次数对提取效果的影响

3.2 多糖正交实验结果 测定结果经极差直观分析见表2、3可知，各因素对熟地水溶性多糖提取效果的影响程度依次为:提取时间＞提取次数＞超声温度＞料液比。最佳工艺组合为超声温度60℃，提取3次，超声时间60 min，料液比1∶30。按优选的最佳超声提取工艺A2B2C3D1进行验证实验，测定多糖含量(重复3次)，其含量分别为12.85%，12.77%，12.46%。平均含量为12.69%，RSD=1.62%。

表2 水溶性多糖正交实验表

表3 水溶性多糖提取综合评分方差分析结果

4 讨论

本实验以水溶性多糖的得率作为单因素提取工艺的考察指标，能较简便、快捷的确定采用正交实验优选超声波法的基本工艺条件及因素，再以多糖得率及多糖的含量两者作为综合评定正交实验优选超声提取工艺的指标，结果表明，不同超声温度、超声时间、提取次数和料液比都对多糖的提取率有不同程度的影响，其中超声提取时间及次数两种因素对实验结果影响最大。综合实验结果和提取过程中经济成本等因素，本实验确定了超声波提取熟地水溶性多糖的最佳工艺为:超声温度60℃，超声时间60 min，提取次数为3次，料液比1∶30。

［1］ 刘培建，苗明三，高渐联.熟地黄多糖对气血双虚小鼠全血细胞及血清粒－巨噬细胞集落刺激因子水平的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(38): 7543－7546.

［2］ 李发胜，徐恒瑰，李明阳，等.熟地多糖提取物对小鼠免疫活性影响［J］.中国公共卫生，2008，24(9):1109－1110.

［3］ 曾里，夏之宁.超声波和微波对中药提取的促进和影响［J］.化学研究与应用，2002，14(3):245－249.

［4］ 宋崎，周小初，宋英，等.益母草炮制工艺的优化［J］.时珍国医国药，2009，20(3):709－710.