卡贝缩宫素和D型改良缩宫素在促人MG－63细胞增殖方面与天然缩宫素活性的比较

钱 明 段蒙娜 曲 进 刘 敏 (吉林大学口腔医院修复科，吉林 长春 130021)

卡贝缩宫素和D型改良缩宫素在促人MG－63细胞增殖方面与天然缩宫素活性的比较

钱 明 段蒙娜 曲 进 刘 敏 (吉林大学口腔医院修复科，吉林 长春 130021)

目的 比较卡贝缩宫素和D型改良缩宫素两种缩宫素替代物在促人骨肉瘤细胞系MG－63增殖方面的效果与天然缩宫素是否存在差异。方法 用含两种缩宫素替代物10、50、100、200 nmol/L的培养基孵育MG－63细胞5 d，用MTT法检测细胞增殖活力的变化，设空白对照组。同时以最低有效浓度50 nmol/L缩宫素作为标准组，比较两种缩宫素替代物在促MG－63增殖方面是否具有与缩宫素相同的生物活性。结果 D型改良缩宫素各浓度组与空白对照组相比无显著性差异(P＞0.05);100 nmol/L和200 nmol/L卡贝缩宫素组与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05);100 nmol/L卡贝缩宫素组与50 nmol/L缩宫素组比较无显著性差异(P＞0.05)。结论 卡贝缩宫素在促进MG－63细胞增殖方面具有与缩宫素相同的生物活性;D型改良缩宫素的生物活性却大大减弱。

缩宫素;卡贝缩宫素;D型改良缩宫素

缩宫素(oxytocin)是一种G蛋白耦联受体激动剂，在成骨细胞和其前体骨髓间充质细胞、脂肪间充质细胞表面都存在缩宫素相关的G蛋白耦联受体。目前，国内外研究已表明了其在全身应用治疗骨质疏松和局部应用促进骨缺损愈合方面的广阔前景〔1，2〕。局部应用药物促进骨缺损愈合需要克服的问题是如何使药物长效作用，而常用的解决方法包括使用缓释载体和延长药物半衰期。缩宫素在体内通过肝、肾代谢，被血液中的细胞色素P450单胺氧化酶识别和降解，半衰期仅有4 min左右。卡贝缩宫素是一种人工合成的缩宫素类似物，在血液中有较长的半衰期，目前仅在产科领域应用，有与缩宫素相近的作用，促进平滑肌收缩。D型改良缩宫素是用D型氨基酸合成的、与天然缩宫素呈手性对称的对映体，同样具有逃避细胞色素P450单胺氧化酶识别、延长半衰期的作用。本研究以人骨肉瘤细胞系MG－63为模型，比较两种缩宫素的替代物在促进成骨细胞增殖方面是否与天然缩宫素具有同样的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 MG－63购自上海细胞生物研究所;OT购自上海肽仕生物科技有限公司;Carbetocin购自上海吉尔生化有限公司;MTT购自Sigma公司;胎牛血清、低糖DMEM及二甲基亚砜购自杭州四季青公司。

1.1.2 实验仪器 台式高速离心机(Hermlez323K，美国)，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)，超净工作台(上海医疗器械厂)，酶标仪(Bio－Rad，美国)，ZORBAX Poroshell 300Å 液相色谱柱(Agilent，美国)，CO2恒温培养箱(SANOY，美国)，电子天平(上海生物仪器厂)，无菌手术器械、细胞培养管及细胞培养瓶。

1.2 方法

1.2.1 D型改良缩宫素合成 以Rink MBHA Amide Resin树脂为载体，采用Fmoc固相合成方法进行多肽合成。然后用三氟乙酸从树脂上剪切，真空冷冻干燥。利用高效液相色谱反相柱技术分离、纯化及制备。利用 Zorbax 300 SB－C8柱子，含0.1%三氟乙酸的水溶液和含0.1%三氟乙酸的乙腈做线性梯度分离，流速为2 ml/min，得到高纯度D型改良缩宫素，备用。

1.2.2 细胞培养及鉴定 用含15%小牛血清的F12培养基、5%CO2全湿度、37℃条件下孵育MG－63细胞，12 h细胞贴壁，每间隔2 d换液，3 d后细胞生长良好，呈长梭型，折光性良好、边界清晰。7 d后细胞融合达80%，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，0.25%胰酶消化，1∶2传代。至传3代后生长稳定，备用。

1.2.3 MTT检测两种缩宫素替代药物对MG－63细胞增殖的影响 将处于对数期生长的MG－63细胞用0.25%胰酶消化，15%小牛血清的F12培养基终止消化。通过细胞计数板将细胞悬液调整至2.5×104/m l。取96孔板加样200μl，5%CO2全湿度、37℃条件下孵育24 h至细胞贴壁。卡贝缩宫素和D型改良缩宫素分别设10、50、100、200 nmol/L四个梯度;另设空白对照，每组设3个复孔，孵育时间5 d。每孔加噻唑蓝20μl，4 h后取出原液，加入DMSO 150μl，摇床振荡15min，在酶标仪490 nm波长下测量各孔的吸光度。

1.2.4 两种替代药物与缩宫素作用效果的比较 将50 nmol/L作为缩宫素的最低有效浓度，作用于MG－63细胞系5 d，MTT法检测其A值。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

卡贝缩宫素组随着药物浓度的增加，A值逐渐升高，表现出剂量依赖性，当浓度超过100 nmol/L时与空白对照组(0.687±0.015)有显著性差异。D型改良缩宫素组A值随药物浓度变化不明显，各浓度梯度与空白对照组未见显著性差异。50 nmol/L浓度缩宫素组A值为0.816±0.025，与对照组比较有显著性差异。不同浓度卡贝缩宫素及D型改良缩宫素组A值比较，卡贝缩宫素在促进MG－63细胞增殖方面与缩宫素具有相近的效果，而D型改良缩宫素在促进MG－63细胞增殖方面没有明显效果。见表1。

表1 不同浓度卡贝缩宫素以及D型改良缩宫素作用于MG-63细胞5 d时A值的变化(±s)

表1 不同浓度卡贝缩宫素以及D型改良缩宫素作用于MG-63细胞5 d时A值的变化(±s)

与10 nmol/L比较:1)P＜0.05

10 nmol/L 50 nmol/L 100 nmol/L 200 nmol/L卡贝缩宫素组 0.695±0.017 0.760±0.021 0.820±0.0191) 0.871±0.0161)组别0.013 D型改良缩宫素组 0.702±0.019 0.704±0.010 0.710±0.015 0.721±

3 讨论

卡贝缩宫素和D型改良缩宫素是为了克服缩宫素体内半衰期短、容易被细胞色素P450单胺氧化酶识别和降解的副作用而使用的替代性药物。两种药物通过不同的机制能够有效延长其在体内的半衰期〔3〕，但通过本实验发现，卡贝缩宫素在促进MG－63细胞增殖方面仍具有与缩宫素相同的生物活性，但D型改良缩宫素的生物活性却大大减弱。

D型改良缩宫素是通过人工合成得到的与缩宫素呈镜像对称的手性对映体。受体与配体的识别具有高度空间特异性，即配体表面a、b、c三个基团与配体表面X、Y、Z活性作用点结合才表现出较高的活性〔4〕。D型改良缩宫素虽然通过改变空间结构逃避体内特异性酶的识别延长了半衰期，但可能正是因为空间构象发生了改变，使三个特异性位点中只有两个能够结合，降低了与细胞表面功能性受体的结合能力。这就可以解释D型改良缩宫素无法有效促进MG－63细胞增殖的原因。

卡贝缩宫素与缩宫素相似，同样由9个氨基酸组成。缩宫素肽链中位于1、6位的半胱氨酸之间形成二硫键，二硫键是蛋白质二三级结构的稳定中心，也是体内细胞色素P450单胺氧化酶识别和降解的位点。而卡贝缩宫素则是由－CH2－CH2－SCH2－结构替代了缩宫素1、6位半胱氨酸间的二硫键，所以在体内的半衰期能够延长10倍以上。但卡贝缩宫素中各活性基团的空间位置与缩宫素基本一致，所以对MG－63细胞表面的功能性受体仍具有高度的特异性，表现出与缩宫素一样的高活性〔5〕。

综上所述，卡贝缩宫素是一种在调节成骨细胞增殖方面与缩宫素具有相似作用的人工合成药物，且具有体内半衰期较长的特点，在局部应用缩宫素调节骨代谢、促进骨缺损愈合的过程中可以作为缩宫素的替代药物使用。

1 Tamma R，Colaianni G，Zhu LL，et al.Oxytocin is an anabolic bone hormone〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2009;106(17):7149－54.

2 Elabd C，Basillais A，Beaupied H，et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis〔J〕.Stem Cells，2008;26(9):2399－407.

3 Sclafani A，Rinaman L，Vollmer RR，et al.Oxytocin knockoutmice demonstrate enhanced intake of sweet and nonsweet carbohydrate solutions〔J〕.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2007;292(8):1828－33.

4 Elabd SK，Sabry I，Hassan WB，etal.Possible neuroendocrine role for oxytocin in bone remodeling〔J〕.Endocr Regul，2007;41(4):131－41.

5 Elabd C，Basillais A，Beaupled H，et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis〔J〕.Stem Cells，2008;26(9):2399－407.

R71

A

1005-9202(2012)16-3473-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.058

吉林省科技厅自然科学基金资助课题(No.200705195);吉林大学博士研究生交叉学科科研资助项目(No.450091102521)

刘 敏(1973－)，女，主治医师，硕士，主要从事硬组织代谢及骨替代材料研究。

钱 明(1981－)，男，医师，在读博士，主要从事硬组织代谢及骨替代材料研究。

〔2012－01－09 收稿 2012－01－19 修回〕

(编辑 袁左鸣)