脉络宁对老年性痴呆模型大鼠脑组织SIRT1基因表达的影响

程 念 胡进中 田玲玲 赵欣欣 申军华 李芳芳

(河北医科大学生物化学和分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)

脉络宁对老年性痴呆模型大鼠脑组织SIRT1基因表达的影响

程 念 胡进中 田玲玲 赵欣欣 申军华 李芳芳

(河北医科大学生物化学和分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)

目的观察中药复方脉络宁和谢海洲方，西药维生素(C+E)和阿托伐他汀药物干预对老年痴呆(AD)模型大鼠脑组织SIRT1基因表达的影响。方法用去卵巢同时腹腔注射D-半乳糖大鼠模拟早期AD模型，予以中药复方脉络宁和谢海洲方，西药维生素(C+E)和阿托伐他汀干预，采用Morris水迷宫检测大鼠用药前后学习记忆能力的变化，采用RT-PCR，Western印迹技术检测大鼠颞叶右侧皮层SIRT1基因表达的变化。结果与假手术组相比，去卵巢并注射D-半乳糖组逃避潜伏期明显延长;给药后，与病理组相比，四个给药组总逃避潜伏期明显缩短。与假手术组相比，病理组的SIRT1mRNA和蛋白质的相对表达量明显降低，而与病理组相比，四个给药组的SIRT1mRNA和蛋白质的相对表达量均有不同程度的升高。结论本模型大鼠颞叶皮层SIRT1 mRNA和蛋白质表达水平均降低;而脉络宁，谢海洲方，维生素(C+E)，阿托伐他汀均可以不同程度的升高SIRT1 mRNA和蛋白质的表达水平，提示SIRT1表达的增加可能是这些药物对AD大鼠模型的神经保护作用分子机制之一。

阿尔茨海默病;去卵巢;D-半乳糖;SIRT1;脉络宁

多种因素可导致阿尔茨海默病(AD)的发病，雌激素的缺乏被认为是衰老女性触发AD的原因之一，长期的氧化应激导致的神经细胞炎症和积累的损伤是AD发生发展的另一重要因素。研究表明，SIRT1能够抑制AD模型鼠Aβ、病理斑块的形成和认知能力的下降〔1〕。本研究以去卵巢(OVX)+D-半乳糖(D-gal)双重因素处理的大鼠来制备AD模型，选用中药复方脉络宁和谢海洲方，西药维生素C+维生素E和阿托伐他汀观察其对AD模型的SIRT1基因是否具有调节作用，从而为AD的预防和早期治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物与药物 4月龄雌性SD大鼠48只，普通大鼠饲料喂养，购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证号:710062。脉络宁注射液(南京金陵制药厂)，阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司)，维生素C(天津市永大化学试剂开发中心)，维生素E胶丸(天津美通药业有限公司)，中药(石家庄乐仁堂)。

1.2 主要试剂 反转录试剂盒(Invitrogen公司)，2×Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)，Trizol(Solarbio公司)，PMSF(北京鼎国生物公司)，leupeptin(北京拜尔迪生物公司)，DTT(北京赛百盛生物公司)，GAPDH抗体和SIRT1抗体、ECL(Santa Cruz公司)，辣根酶标记山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥公司)，D-gal(New Jersey USA)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组 选用4月龄雌性SD大鼠48只，常规饲养2 w后随机分为2组:假手术组OVX组，其中假手术组8只、OVX组40只。应用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)对2组大鼠行腹腔内麻醉，取俯卧位，选取大鼠髂前上棘靠头部约1.5～2.0 cm，脊柱旁开约2.0 cm处，常规剪毛消毒、切开皮肤、分离肌肉、切开腹膜，OVX组行双侧卵巢切除术，夹出小网膜脂肪，分离双侧卵巢，小心结扎好卵巢动脉后切除卵巢。假手术组行同样手术程序但仅切除少量小网膜脂肪组织(体积同卵巢大小)，然后依层关腹缝合。术后大鼠用标准实验室饲料喂养，自由进食进水。手术2 w后假手术组给予生理盐水0.5 m l/d，腹腔注射;OVX组给予D-半乳糖 20 mg/d，腹腔注射。注射6 w后将OVX组再次随机分为5组:脉络宁组(ODM)，谢海洲方组(ODZ)，维生素(C+E)组(ODV)，阿托伐他汀组(ODA)及病理对照组(OD)，每组8只。各组均灌胃4 w，灌胃剂量如下:ODM组 脉络宁注射液1.8 ml·kg－1·d－1，ODZ组 中药复方16.83 g·kg－1·d－1，ODV 组 维生素 C 45 mg·kg－1·d－1，维生素 E 27 mg·kg－1·d－1，ODA 组 7.2 mg·kg－1·d－1，假手术组及OD组分别灌服蒸馏水1.5 ml·kg－1·d－1。灌胃过程中OVX组及假手术组继续分别给予D-gal及生理盐水注射。手术后常规喂养12 w后处死。

1.3.2 行为学测试 注射D-gal及生理盐水4 w后，用Morris水迷宫对所有大鼠进行训练，每天4次，每次间隔5min，共4 d，作为学习记忆训练。注射D-gal及生理盐水6 w后进行Morris水迷宫测试，方法同上，测试1 d，以后三次逃避潜伏期的平均值作为评价大鼠记忆能力的指标。动物处死前1 d，同样条件水迷宫1 d，方法同上，记录大鼠逃避潜伏期的平均值，作为评价大鼠空间记忆能力的指标。

1.3.3 标本的获取 用戊巴比妥钠(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉，剪开头皮，用止血钳沿大鼠头颅中央骨缝撬开，迅速分离脑组织，剥取颞叶右侧皮层置液氮中，于－80℃低温冰箱保存，用于组织总RNA及总蛋白的提取。

1.3.4 SIRT1 mRNA检测 用Trizol法提取总RNA;RNA鉴定和定量;反转录反应;PCR反应;取目的基因和GAPDH的PCR产物各5μl，2%琼脂糖凝胶电泳。用江苏捷达凝胶成像分析系统照相得到目的基因与GAPDH的扩增产物的积分光密度值(I)，计算二者的比值(I目的基因/IGAPDH)，以此作为目的基因的相对表达量。

1.3.5 SIRT1蛋白表达检测 提取Lowry法测蛋白含量。采用Western印迹方法检测SIRT1蛋白的相对含量。用凝胶成像分析仪采集图像并用软件进行分析。GAPDH作内参照。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理，数据以±s表示，多组间均值的比较用单因素方差分析。经检验各组方差齐，进一步组间比较选用SNK多重比较检验。经检验方差不齐，进一步组间比较选用Dunnett T3多重比较检验。

2 结果

2.1 学习记忆能力的变化 各训练组大鼠逃避潜伏期随训练次数增加而缩短，取最后三次逃避潜伏期的平均值进行观察，OVX+D-gal组逃避潜伏期明显长于假手术组〔(8.7±4.1)vs(15.2±8.1)s，P＜0.05〕，提示雌激素缺乏同时注射D-gal会引起大鼠学习记忆能力下降;将各用药组逃避潜伏期单独与OD组进行比较则无统计学差异，这可能是各组例数较少之故。若将ODM+ODZ+ODV+ODA组的例数相加，其逃避潜伏期明显短于OD组〔(9.1±6.5)vs(16.7±12.3)s，P＜0.05〕，提示脉络宁注射液，谢海洲方，维生素C+E，阿托伐他汀能改善去卵巢同时注射D-gal对大鼠学习记忆能力的损伤。

2.2 SIRT1 mRNA水平的变化 与假手术组(0.624±0.030)相比，OD组(0.464±0.063)的SIRT1 mRNA相对表达量明显降低(P＜0.05);与OD组相比，ODM组(0.968±0.127)、ODZ组(0.859±0.119)，ODV组(0.790±0.076)和 ODA组(0.603±0.091)的SIRT1 mRNA相对表达量均有不同程度的升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中，以ODM组SIRT1 mRNA升高效果最明显。见图1。

2.3 SIRT1蛋白相对含量的变化 与假手术组(0.906±0.085)相比，OD组(0.581±0.199)SIRT1相对表达量明显降低(P＜0.05);与 OD 组相比，ODM(2.023±0.288)组、ODZ组(1.818±0.287)、ODV 组(1.605±0.225)、ODA 组(1.033±0.091)的SIRT1相对表达量均有不同程度的增加(P＜0.05)，其中，以ODM组SIRT1升高效果最明显。见图2。

图1 SIRT1 mRNA在大鼠颞叶右侧皮层的表达

图2 SIRT1蛋白在大鼠颞叶右侧皮层的表达

3 讨论

有各种证据表明SIRT1参与到神经系统保护、突触可塑和学习记忆中〔2〕。SIRT1通过与不同的非组蛋白和组蛋白相互作用来完成不同的功能。SIRT1的激动剂白黎芦醇可以使SIRT1的酶活性增加〔3〕，热量限制可以使 SIRT1的表达增加〔4〕，一些小分子化学物质可抑制 SIRT1的表达和酶的活性〔5〕，这些现象都说明SIRT1的表达是受到众多因素影响的。脉络宁注射液是由玄参、牛膝等中药制成的复方静脉滴注剂，具有滋补肝肾，养阴清热，活血化瘀的功效，临床常用于改善微循环的功能，对脑梗死及其后遗症、脑供血不足和短暂性脑缺血发作及缺血导致的AD具有良好的预防和治疗作用〔6〕。谢海洲方是中国中医研究院谢海洲教授治疗脑髓病的经验方〔7〕，方中重用黄芪补气升阳;人参、白术、茯苓健脾益气安神;佐以生地清热凉血，养阴生津;当归、制首乌、枸杞子滋阴养血;山茱萸补益肝肾;巴戟天、淫羊藿、肉苁蓉温补肾阳，全方具有补肾健脾，填精养血，平补肝肾，益气养脑的功效，常服可以改善记忆障碍，增强老年人记忆力。维生素C与维生素E都是临床上常用的抗氧化剂，大剂量长时间给予维生素(C+E)能更好地降低AD病人体内脂蛋白的氧化作用。胆固醇的增高也是AD的风险因素，阿托伐他汀主要药理作用是抑制胆固醇合成的限速酶HMG2CoA还原酶，从而降低胆固醇的生成，同时还具有抗氧化、抗炎症、抗血小板聚集、神经保护等多种作用，可以减缓AD的发生发展〔8〕。本研究首次证实这4种药物均可通过上调SIRT1的表达而对抗AD的发生发展的作用，其上调SIRT1表达的机制不清。

1 Donmez G，Wang D，Dena E，et al.SIRT1 Suppressesβ-amyloid production by activating the α-secretase gene ADAM10〔J〕.Cell，2010;142:320-32.

2 Bonda DJ，Lee H，Camins A，et al.The sirtuin pathway in aging and Alzheimer disease:mechanistic and therapeutic considerations〔J〕.Lancet Neurol，2011;10:275-9.

3 Elizabeth D，Brookins D.Resveratrol prevents doxorubicin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1 pathway〔J〕.Free Radical Biol Med，2009;46:1589-97.

4 Csiszar A，Labinskyy N，Jimenez R，et al.Anti-oxidative and anti-inflammatory vasoprotective effects of caloric restriction in aging:role of circulating actors and SIRT1〔J〕.Mech Ageing Dev，2009;130(8):518-27.

5 Lawson M，Uciechowska U.Inhibitors to understand molecular mechanisms of NAD+-dependent deacetylases(sirtuins)〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1799:726-39.

6 郭志力，戴 翔，曲东锋.脉络宁药理研究和临床研究及其在缺血性脑血管病中的应用现状及前景〔J〕.中国全科医学，2004;7(24):1849-50.

7 谢海洲.谢海洲教授治疗脑髓病的经验〔J〕.河南中医，2003;23(12):16-7.

8 Catarina A，Fonseca RG，Resende R，et al.cholesterol and statins in Alzheimer's disease:current controversies〔J〕.Exper Neurol，2010;223:282-93.

Influence of Mailuoning on SIRT1 expression of brain tissue in Alzheimer's disease ratmodel

CHENG Nian，HU Jin-Zhong，TIAN Ling-Ling，et al.
Department of Biochem istry and Molecular Biology，HebeiM edical University，Shijiazhuang 050017，Hebei，China

ObjectiveTo investigate the effect of Mailuoning，traditional Chinese medicine recipe(Xie haizhou)，vitamin C+E and atorvastatin on the expression of SIRT1 gene.MethodsOvariectomized rats injected with D-galwere selected.Learning and memory abilities were evaluated by Morriswatermaze.Content of SIRT1mRNA wasmeasured by RT-PCR.Contentof SIRT1 protein wasmeasured by Western-blotting.ResultsEscape latency was longer in the OVX+D-gal group compared with that of sham group，and shorter in treatment groups compared with thatof the OVX+D-gal group.Compared with those of sham，the expressions of SIRT1 mRNA and protein were lower in those of OVX+D-gal group.Compared with OVX+D-gal group，the expressions of SIRT1 mRNA and protein in treatments group were higher.ConclusionsMailuoning，traditional Chinesemedicine recipe(Xie haizhou)，vitamins(C+E)and atorvastatin can increase the expression of SIRT1 mRNA and protein levels respectively in different degrees，which suggests that increased expression of SIRT1 could be one of themolecularmechanisms of neuroprotection of these drugs on AD ratmodel.

Alzheimer's disease;Ovariectomized;D-gal;SIRT1;Mailuoning

R339.3+8;R34;R363.2+1

A

1005-9202(2012)16-3462-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.053

2005年度河北省科学技术研究与发展指导计划支持项目(05276454)

李芳芳(1958-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事脑衰老的分子基础和中药防治研究。

程 念(1984-)，女，硕士，主要从事医学检验工作。

〔2011-06-22收稿 2011-09-12修回〕

(编辑 曹梦园)