代谢型谷氨酸受体3基因多态性与酒依赖的关联研究☆

唐春玲 胡建 夏炎

代谢型谷氨酸受体3基因多态性与酒依赖的关联研究☆

唐春玲*胡建*夏炎*

目的 探讨中国北方汉族人群代谢型谷氨酸受体3（GRM3）基因多态性与酒依赖的相关性。方法采用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和连接酶检测反应（Ligase Detection Reaction，LDR）方法，检测100例酒依赖患者和100例正常对照的GRM3基因上3个位点rs1468412、rs917071和rs1989796的基因多态性。结果 酒依赖组和对照组之间GRM3基因rs1468412、rs917071以及rs1989796位点的等位基因频率和基因型分布的差异均无统计学意义（P＞0.05），但酒依赖组中rs1468412、rs917071和rs19897963个位点所构建的单倍型 TTT的频率明显高于对照组 （6% vs.1%，OR ＝5.17，P＜0.05），TTT基因型携带者患酒依赖的可能性较高。结论 在本样本中，中国北方汉族人群GRM3基因rs1468412、rs917071和 rs1989796位点的多态性单独存在时与酒依赖无关联，而由此3个位点所构建的单倍型TTT可能为酒依赖的易感危险因素。

代谢型谷氨酸受体3 单核苷酸多态性 酒依赖

酒依赖（alcohol dependence，AD）是由于长期反复饮酒所致的对酒渴求的一种特殊的心理状态。近年来其患病率明显增加，但其确切发生机制仍不十分清楚。目前研究认为酒依赖是受遗传－生物－社会心理等多种因素影响的一种疾病。大量研究已证实酒依赖与遗传因素密切相关［1］。代谢型谷氨酸受体3（metabotropic glutamate receptor 3，GRM3）主要分布于突触前膜，在谷氨酸能神经传递中发挥重要效应，可产生突触前抑制作用，降低突触谷氨酸的水平，而谷氨酸在酒依赖的发病中可能起到重要的作用［2－3］。目前对谷氨酸受体的研究多集中于NMDA受体，而代谢型受体的研究较少。本文通过测定200名受试者的GRM3基因3个多态位点rs1468412、rs917071及rs1989796的多态性，探讨其在中国北方汉族人群酒依赖发病机制中的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 为来自2008年5月至2009年10月来哈尔滨医科大学附属第一医院精神科门诊就诊的酒依赖患者。入组标准：①符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版 《美国精神障碍诊断与统计手册第 四 版 》 （Diagnosic and Statistic Manual of Mental Disorder， Fourth Edition， DSM-Ⅳ）关于酒依赖的诊断标准；②中国北方汉族男性；③年龄18～60岁。排除标准：①两系三代中有异族通婚史；②患有其他精神疾病史；③除酒精以外有其他药物成瘾史；④患有中枢神经系统、心血管系统疾病和其他重大躯体疾病史；⑤有遗传疾病家族史。共100例酒依赖患者，年龄 31～ 60 岁，平均（45.49± 5.69 岁）。

对照组为来自哈尔滨医科大学附属第一医院体检中心的健康志愿者。入组标准：①中国北方汉族男性；②年龄18～60岁；③与酒依赖先证者在年龄、教育程度、职业性质相匹配，社会关系及精神心理状态良好。排除标准：①家系中有酒精和药物成瘾者；②患有精神疾病史；③患有中枢神经系统、心血管系统疾病和其他重大躯体疾病史；④有遗传疾病家族史。对照组100名，年龄35～59岁，平均（44.78 ± 4.71 岁）。 两组的年龄差异无统计学意义（t＝ 1.97，P ＞ 0.05）。

本研究通过哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准，所有研究对象自愿参加并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 抽取受试者肘静脉血 5 mL置于EDTA抗凝管，应用AxyPrep-96全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度。

1.2.2 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR） 各位点引物分别为：rs1468412位点上游引物TGATATGTTCCTTCAGCTTGC，下游引物AGCCATG CAGTGGCAGAT；rs 917071位点上游引物ACCACAAGGCTTCAG CTCAT，下游引物TGC TACTGAGTTCTCCAGCGTA；rs1989796位点上游引物CAACCTC TGCCTCCTGGAT，下游引物CCCATGATGAACACAATGTCA。三位点进行复合PCR反应。反应物：在1.5mLeppendorf离心管中分别加入200 μLPCR-buffer （10×），60 μLMg2＋（100mmoL），200 μL dNTP （20mmoL），20 μLTaq 酶 （5U／μL），400 μLQ-solution（4×），40 μL primer（5 pmoL），最后加入980μL去离子水，充分混匀后离心，再取19μL分装在200μL的PCR反应管中，最后再加入1μL基因组DNA进行PCR。PCR反应条件：95℃变性 15min，然后 94℃ 30 s、56℃ 1min 30 s、72℃1min 35个循环，最后在72℃延伸7min。

1.2.3 连接酶检测反应 （ligase detection reaction，LDR） 在1.5mL eppendorf离心管中分别加入100 μL buffer （10×），100 μL Probe Mix，5 μL 连接酶，695μL去离子水，充分混匀后离心，再取9μL分装在200μL的PCR反应管中，最后再加入1μL PCR反应产物。反应条件：95℃变性2min，然后94℃ 30 s、50℃2min 30个循环。各取 1μL LDR 连接产物与1μL ABIGS-500 ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于5%聚丙烯酰胺和5mol／L尿素中 3000 V电泳 2.5 h，应用 GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

1.3 统 计 分析 应用 SPSS 15.0进行 Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验，以及酒依赖组与对照组间各位点等位基因频率及基因型分布的χ2检验。应用SHEsis软件进行连锁不平衡检验及单倍型分析［4］。 检验水准 α ＝ 0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 两组Hardy-W einberg遗传平衡检验 经χ2检验，3个位点在酒依赖组和对照组的各基因型频率分布符合 Hardy-Weinberg平衡 （χ2＝ 0.12，P ＞0.05），表明两组被试者来自大的群体，个体间随机婚配，不存在明显自然选择、迁移等对遗传平衡有影响的因素，具有群体代表性。

2.2 两组3个位点等位基因和基因型的频率分布酒依赖组和对照组之间的GRM3基因的rs1468412位点的等位基因频率和基因型分布差异无统计学意义 （χ2＝ 1.27，P ＞ 0.05；χ2＝ 2.90，P ＞0.05）；两组的rs917071位点等位基因频率和基因型分布差异无统计学意义 （χ2＝ 0.74，P ＞ 0.05；χ2＝ 0.09，P ＞ 0.05）； 以及 rs1989796 位点等位基因频率和基因型分布差异无统计学意义（χ2＝0.22，P ＞ 0.05；χ2＝ 0.16，P ＞ 0.05）。 见表 1。

2.3 连锁不平衡和单倍型分析 由SHEsis软件计算出各位点间连锁不平衡系数D′（＝D／Dmax），得 出 rs1468412-rs917071 的 D′值 为 0.66，rs1468412-rs1989796 的 D′值为 0.72， rs917071-rs1989796的D′值为0.49，表示两两位点间均处于紧密连锁，可以进行单倍型分析。 在酒依赖组和对照组之间，rs1468412-rs917071所构建的4种单倍型分布差异无统计学意义 （P＞0.05）；rs1468412-rs917071所构建的4种单倍型分布差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；以及 rs917071-rs1989796 所构建的4种单倍型分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。rs1468412-rs917071-rs1989796所构建的8种单倍型中，单倍型TTT在酒依赖组中的频率明显高于对照组（χ2＝ 5.42，P ＜ 0.05）。 见表 3。

3 讨论

本研究结果显示，酒依赖组和对照组中GRM3基因的rs1468412位点、rs917071位点以及rs1989796位点等位基因和基因型频率无差异，不支持该基因与酒依赖关联。但考虑到下述原因：本研究的样本量较小，提供的信息量有限；疾病的发生与发展是多种环境因素、遗传因素相互作用的结果。本文没有分析研究对象的一般特征和其他环境变量；可能存在很多未知通路，或者存在连锁不平衡，或者是基因多效性等等。本研究进一步做了连锁不平衡分析和单体型分析，结果显示rs1468412与rs917071之间、rs1468412与 rs1989796之间以及rs917071与rs1989796之间均处于紧密连锁。未发现两两位点构建的单体型与酒依赖关联，但3个SNP位点所构建的单倍型TTT与酒依赖的发病关联，其关联比值比远大于这3个SNP位点单独存在以及两两组合时的关联比值比，表明3个SNP位点在酒依赖发病中呈现一定的协同作用，单倍型TTT可能是酒依赖的易感因素。目前尚无GRM3基因与酒依赖关联的相关报道，不过，这与其他研究显示的GRM3受体与酒依赖相关的报道吻合 。Bäcksträm 等［5－6］研究发现 GRM2／3受体激动剂LY379268可以削弱酒依赖大鼠戒断后因酒精刺激和环境刺激引起的觅酒行为，减少自我给药剂量。而Rodd 等［7］发 现 GRM2／3受 体 激 动 剂 LY404039 可 以减轻遗传嗜酒大鼠的觅酒和复饮行为，却不能改变自我给药剂量。此外，GRM2／3受体激动剂还可以减轻环境暗示诱导的可卡因和海洛因觅药行为，减少可卡因的自我给药。这些研究结果都支持激动GRM3受体可以预防酒依赖和药物成瘾的复发。Worst等［8］发现遗传性嗜酒大鼠品系AA与非嗜酒鼠品系ANA相比，GRM3的mRNA水平明显下调。而且有研究表明谷氨酸受体配体能够改变酒精的强化效应，因此已经成为治疗物质依赖的一种潜在的治疗方法［9］。

表1 两组GRM 3基因3个位点的等位基因和基因型的频率分布 n（%）

表2 两组GRM 3基因3个位点的单倍型频率分布比较 n（%）

表3 两组GRM 3基因3个位点的单倍型频率分布比较 n（%）

GRM3基因与酒依赖关联的可能机制分析如下：谷氨酸系统参与调控中脑－边缘多巴胺通路［10］，目前的研究认为此通路是犒赏系统的主要机制。该系统起自中脑腹侧被盖区（VTA），向伏隔核（NAc）的投射。从伏隔核的解剖结构和功能活动可以看出，多巴胺、谷氨酸递质与精神活性物质的效应存在密切联系［11］。谷氨酸能神经从前额叶皮质、终纹状体、背外侧被盖核及外侧下丘脑投射到VTA，从前额叶皮质、下丘脑、杏仁核、室旁核投射到NAc，神经元末梢释放的谷氨酸作用于NAc壳部的谷氨酸受体，引起多巴胺释放［12］。VTA分布有谷氨酸能神经元，可能通过不同的谷氨酸受体影响多巴胺能活动。通过对复吸的研究证明伏隔核中谷氨酸的释放是启动觅药行为的生物学信号，事实上，阻断伏隔核中谷氨酸受体比阻断多巴胺受体更能遏止因复吸而出现的觅药行为。

GRM3基因可能在多种精神疾病的发病中起到作用。比如，GRM3基因可能通过调节谷氨酸及其他神经递质促发精神分裂症。目前已有研究显示 GRM3基因 rs1468412 位点［13］、rs2299225 位点［14］的等位基因或相关单倍型可能与精神分裂症存在关联。因此，GRM3基因多态性与酒依赖、精神分裂症等疾病的关系仍需要进一步明确。寻找酒依赖的易感基因，从基因水平筛选高危人群以提供早期干预、诊断和治疗方法，有着明显的临床和社会意义。本研究的样本量仍较小，下一步仍应扩大样本量或在不同样本中加以验证。而且，社会心理因素的作用也不容忽视，在今后的研究中应当将这种因素适当地考虑进去。

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An association study of GRM 3 polymorphism s with alcohol dependence in a Han Chinese population.

TANG Chunling， HU Jian， XIA Yan.Mental Health Institute， 1st affiliated hospital of Harbin Medical University，Harbin， 150001， China.Tel： 0451－85553553.

ObjectiveTo investigate the association ofmetabotropic glutamate receptor 3 （GRM3） gene polymorphisms and alcohol dependence in a Han Chinese population in northern China.M ethods Polymerase chain reaction （PCR） and ligase detection reaction （LDR） were used to detect 3 single-nucleotide polymorphisms （SNPs）rs1468412，rs917071 and rs1989796 onmetabotropic glutamate receptor 3 gene in 100 patientswith alcohol dependence and 100 controls.Results There was no significant difference between the alcohol dependence group and the control group in the allele frequency and genotype distribution of those three SNPs.Haplotype TTT constructed by those three SNPs loci rs1468412-rs917071-rs1989796 was positively associated with the incidence of alcohol dependence（AD group 6%， control group 1%， OR ＝ 5.17， P ＜ 0.05）.The possibility of alcohol dependence was higher in the patients carrying TTT genotype than in the controls.Conclusion The present study has not revealed any association between each SNP（rs1468412， rs917071， and rs1989796） of the GRM3gene and alcohol dependence in this northern Chinese Han population.However， The haplotype TTT constructed by the three SNPs is positively associated with alcohol dependence， indicating that GRM3may be a susceptible factor of alcohol dependence in northern Chinese Han population.

Metabotropic glutamate receptor 3 Single nucleotide polymorphism Alcohol dependence

R749.1＋6

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.007

☆ 国家自然科学基金资助项目（编号：30670754）

* 哈尔滨医科大学附属第一医院精神卫生中心 （哈尔滨150001）

（E-mail：hujian0451＠163.com）

2011－02－11）

文飞）

·论 著·