人脑胶质瘤中IKKε的表达及其意义

李会兵 俞凯 张安玲 王坤 王广秀 康春生 黄强

人脑胶质瘤中IKKε的表达及其意义

李会兵*俞凯*张安玲*王坤*王广秀*康春生*黄强*

目的 探讨IKKε基因在人脑胶质瘤组织中的表达及其意义。方法 收集具有明确病理分级的51新鲜胶质瘤标本，其中Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤24例，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤27例，并取7例内减压去除的脑组织标本作为对照。采用实时定量PCR（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测IKKεmRNA和蛋白水平的表达，免疫组化染色确定IKKε的细胞定位，研究IKKε蛋白表达与胶质瘤病理分级的关系。结果 IKKε mRNA 水平（t＝ 23.734，P＜ 0.05）和蛋白水平（χ2＝ 12.583，P＜ 0.05）在人胶质瘤中的表达显著高于对照脑组织，在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ级组（t＝21.587，P＜0.05）。Western blot结果显示7例对照脑组织6例无IKKε表达 （6／7），24例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤3例中／高表达，27例Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤23例中／高表达。IKKε的表达与人脑胶质瘤病理分级呈正相关（r＝0.513，P＜0.05）。免疫组化染色显示IKKε阳性反应物主要位于胞浆。结论 IKKε在人脑胶质瘤中呈高表达，IKKε的表达与人脑胶质瘤的病理分级相关，可能与人脑胶质瘤的发生及恶性进展有关。

人脑胶质瘤 IKKε病理分级

尽管近年来对胶质瘤的治疗有了很大进展， 但近二十年来恶性胶质瘤患者预后仍无明显改善。IKKε基因作为先天免疫反应和炎症反应的调节者分别调控干扰素和NF-κB通路，近年来被证实出现在肿瘤的恶性转化过程中［1］。本实验通过免疫组化方法，Real-time PCR和 Western blot检测IKKε基因在不同级别胶质瘤组织和对照脑组织中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 研究对象 病例来自环湖医院2010年9月至2011年6月经手术及病理证实，且病理与临床资料完整的胶质瘤患者，共51例，其中男28例，女23例，年龄32～81岁。病程3个月至18个月，所有患者术前未行放化疗。另收集7例脑外伤行内减压的脑组织作为对照组。按照《WHO中枢神经系统肿瘤组织学分类》（2007）标准分级［2］，Ⅰ级5例全部为毛细胞型星形细胞瘤；Ⅱ级19例，包括原浆型星形细胞瘤7例、纤维型星形细胞瘤4例、少枝胶质细胞瘤8例；Ⅲ级15例，包括间变性星形细胞瘤9例，6例间变性少实胶质细胞瘤；Ⅳ级12例均为胶质母细胞瘤。每份样本都分为两份，一份经10%福尔马林固定后作免疫组织化学检测，另一份经液氮速冻后储存－80℃，用于提取RNA和蛋白质。主要试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司），反转录及PCR试剂盒及引物（TaKaRa公司），RIPA裂解液及超敏发光液（普利莱公司），ABC试剂盒（Vector公司），浓缩型DAB试剂盒（北京中杉生物工程公司），兔抗人IKKε抗体（Sigma公司），鼠抗人GAPDH抗体（北京中杉生物工程公司）。

1.2 免疫组化染色检测IKKε表达量 石蜡切片脱蜡脱水，置于3%H2O2溶液中室温孵育30min后，置于抗原修复液中97℃微波修复1 h，1%胎牛血清室温封闭20min，吸去封闭液后滴加稀释好的一抗（1∶100），阴性对照用PBS分别代替一抗作为空白对照，置于湿盒内， 4℃过夜，次日PBS洗5 min，3次，滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液，37℃孵育1 h，PBS洗5min，3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育1 h，DAB显色1～3min后进行苏木精复染，盐酸分化，脱水，透明，树胶封片。使用OLYMUS图像采集系统照相。每张玻片在高倍镜（×200）下随机选取5个视野，每视野计数200个细胞， 阳性分级标准为：阳性细胞率在0～10%为（－）；11%～ 40% 为低表达（＋）；41%～ 75%为中表达（＋＋）； ＞ 76%为高表达（＋＋＋）。

1.3 Real-time PCR检测IKKεmRNA的表达Trizol提取总RNA，Nanodrop仪测RNA纯度，取2μg总RNA逆转录为cDNA，进行Real-time PCR扩增，以β-actin为参照。扩增体系 20μL：realtime sybgreen 9 μL，special primer set 1 μL，ddH2O 9μL，cDNA 1μL。反应条件：预变性 95℃，10min，之后每一步变性 95℃，15 s，退火 60℃，1min，延伸60℃，1min，以上步骤循环40次，最后72℃继续延伸 5 min。 IKKε上游引物 5′-GGAGTGCGTGCAGAAGTATCAA-3′， 下 游 引 物 5′-CAGCCACAG AACAGCCAACC-3′，β-actin 上 游 引 物 5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物 5′-GCTGTCACCTTC ACCGTT-3′。Real-time PCR结果判定：ΔCT ＝ CTIKKε-CTβ-actin，ΔΔCT ＝ ΔCT肿瘤组-ΔCT对照组，mRNA 相对表达量 ＝ 2－ΔΔCT［3］。

1.4 W estern blot检测IKKε蛋白表达 RIPA裂解液裂解，冰上消化15min，离心取上清并行BCA法定量， 30μg蛋白上样于10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜并用1%脱脂奶粉于室温条件下封闭2 h，一抗（IKKε1∶1000稀释，GAPDH 1∶1000稀释）4℃孵育过夜，次日 PBS洗5 min，3次，HRP标记的二抗孵育 1 h，PBS洗5 min，3次，将超敏发光液加在PVDF膜上，曝光显影，凝胶成像系统采集图像对每个样本光密度值进行分析，光密度扫描仪检测出目的条带图像峰面积值，以峰面积值的比值代表蛋白的表达量。

1.5 统计学处理 实验均独立重复3次。实验数据采用SPSS 11.5处理，χ2检验、单因素方差分析和spearman相关分析法进行分析。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 免疫组化显示IKKε蛋白的染色 免疫染色的结果显示7例对照脑组织中6例无IKKε蛋白的表达，1例为低表达；5例Ⅰ级毛细胞性星型细胞瘤4例无表达，1例IKKε蛋白中表达。11例Ⅱ级星型细胞瘤9例低表达，2例高表达；8例少突胶质细胞瘤均低表达。9例Ⅲ级间变型星型细胞瘤5例高表达，2例中表达，1例低表达，1例无表达；间变型少突胶质细胞瘤4例高表达，1例中表达，1例低表达。12例Ⅳ级胶质母细胞瘤11例高表达，1例低表达。在胶质瘤标本中，IKKε蛋白主要定位于细胞浆，表现为黄色或棕黄色着色（图1），在对照脑组织和不同级别胶质瘤中IKKε的阳性表达率分别为14%、88%，两者比较差异具有统计学意义（χ2＝ 12.583，P ＜ 0.05），spearman 相关分析提示IKKε 和肿瘤级别呈正相关 （r＝ 0.513，P ＜ 0.05）。此外，胶质瘤组织IKKε蛋白的表达在不同性别、组织学及年龄中无明显差异 （P ＞ 0.05）（表 1），差异不具有统计学意义。

2.2 IKKεm RNA 表达结果 见表 2，IKKε在不同级别胶质瘤组织中随着肿瘤恶性程度的增加，其 mRNA平均表达量 2－ΔΔct也明显增加，对照组IKKε mRNA 相对表达量（1.73±0.15）明显低于胶质瘤组（5.84 ± 0.56）（t＝ 23.734， P ＜ 0.05）；胶质瘤I～Ⅱ级组和胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级组行方差分析显示IKKεmRNA在胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级中的表达高于胶质瘤 I～Ⅱ级（t＝ 17.587，P ＜ 0.05），见表 2。

图1 免疫组化染色检测对照脑组织及不同级别胶质瘤组织中IKKε 细胞内分布及表达量（×200）。 a：对照组；b：Ⅰ级组；c：Ⅱ级组；d：Ⅲ级组；e：Ⅳ级组

图2 Western blot检测对照脑组织（c）及不同级别（Ⅰ～Ⅳ）胶质瘤组织中IKKε蛋白表达水平

表1 胶质瘤中IKKε表达特点

表2 IKKεmRNA在对照脑组织及人脑胶质瘤中的表达（±s）

表2 IKKεmRNA在对照脑组织及人脑胶质瘤中的表达（±s）

1）经t检验，对照组与胶质瘤组比较，P＜0.052）经 LSD-t检验，对照组、Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ级组两两比较，P 均 ＜ 0.05

组别对照组胶质瘤组I～Ⅱ级Ⅲ～Ⅳ级n 7 5 1 24 27 IKKεmRNA（x± s）1.73 ± 0.15 5.84 ± 0.561）4.85 ± 0.142）7.21 ± 0.322）

2.3 IKKεW estern blot结果 见图 2，对照组织中 IKKε 蛋白表达（0.139 ± 0.009）明显低于胶质瘤组织 （2.117±0.063）， 在肿瘤蛋白中不同级别的IKKε蛋白含量也有显著差异差异，且随着胶质瘤级别的增高，IKKε的蛋白表达量也随之增加 （P＜0.05）。 其 中Ⅰ级（0.848 ± 0.028）、Ⅱ级 （1.502 ±0.152）、 Ⅲ 级 （2.411 ± 0.151）、 Ⅳ 级 （3.707 ±0.287）。

3 讨论

近年，大量研究聚焦于慢性炎症和癌症的联系，经典IKK激酶IKKα、IKKβ和核转录因子NF-κB被证实是起桥梁作用的重要的因子［4］。新近的研究揭示IKK相关激酶IKKε和TBK1不仅调控先天免疫反应和炎症反应，也参与众多影响细胞转化和肿瘤进程的通路，尤其是NF-κB通路［5］。有报道证实 IKKε 在乳腺癌［6］、卵巢癌［7］、前列腺癌［8］中异常表达，Guo 等［7，9］还发现 IKKε 与卵巢癌对顺铂的耐药以及乳腺癌对他莫昔芬耐药机制密切相关。

IKKε作为IKK家族成员之一，其编码基因为IKBKE（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells， kinase epsilon），该基因定位于1q32，包括N端激酶区域，类泛素区域，C端LZ（亮氨酸拉链）结构，以及参与磷酸转移酶活性调节的HLH（Helix-Loop-Helix）基序。IKKε与传统的 IKKα、IKKβ结构上分别有33%和31%的同源性，并且 IKKε 过表达可诱导 NF-κB 活化［10］。 Adliet［11］等发现IKKε在前列腺癌和乳腺癌细胞中表达上调，进一步研究显示IKKε可磷酸化Ser536端激活NF-κB，且阻断该途径可以抑制肿瘤细胞增殖。Sonenshein等［12］证实 IKKε在乳腺癌细胞系 MB231和Hs578T，4／6个乳腺癌病人以及致癌物诱导的鼠类乳癌肿瘤中持续表达。此外，在缺乏IKKε激酶活性的乳腺癌细胞中NF-κB的两个靶向基因Cyclin D1、RelB表达减少，且细胞侵袭力和致瘤性降低。Boehm等［6］使用三个互补的基因组方法确定IKKε为乳腺癌基因，他们建立一个依赖MEK和AKT信号的细胞转化模型，通过筛选替代AKT和诱导肿瘤发生的激酶，发现 IKKε基因在 8／49（16.3%）细胞系和30%的标本中扩增，FISH分析进一步证实在另外的10份标本IKKε拷贝数的增加是其编码基因扩增的结果。免疫染色揭示乳腺癌中IKKε发挥其癌基因作用功能是通过NF-κB因子cREL的核内聚集。而许多肿瘤细胞系中发现过表达的IKKε还可以磷酸化p65的Ser536端，并且NF-κB上游抑制剂可以阻断IKKε诱导的细胞转化。还有研究表明IKKε促进胶质瘤细胞抗凋亡， 采用免疫组化检测 53.5%（38／71）胶质瘤表达IKKε且认为IKKε的过表达与肿瘤级别无相关［13］。

本实验通过免疫组化染色发现在胶质瘤组织中IKKε蛋白的阳性率为88%，而对照脑组织几乎无表达。 在对前列腺癌的研究中 Pe′ant等［14］证实IKKε可以促进炎性因子IL-6和IL-8分泌并且IKKε并不靶向NF-κB，免疫染色进一步发现IKKε定位于前列腺癌细胞细胞核。本实验显示IKKε定位于胶质瘤细胞浆，这说明IKKε表达具有组织特异性，且高级别胶质瘤（Ⅲ～Ⅳ级）细胞胞浆染色显著强于低级别胶质瘤（Ⅰ～Ⅱ级）。我们的结果和之前报告的IKKε与胶质瘤级别不相关的结果不一致，我们认为IKKε可能直接参与了胶质瘤的发生及其恶性进展，其和肿瘤级别正性相关。Western blot在蛋白水平亦显示相同的结果，并且考虑可能IKKε对于胶质瘤中星形细胞型的恶性转化起着一定的作用。Real-time PCR结果显示随着肿瘤级别增高，胶质瘤组织中的IKKεmRNA表达量也相应增加，尤其是恶性度最高的胶质母细胞瘤组织中IKKεmRNA的表达明显高于低级别胶质瘤脑组织，表明IKKε在转录水平上的表达结果与在翻译水平上的表达结果具有一致性， 提示IKKε基因表达调控的主要环节在转录或翻译水平上，IKKε参与并促使肿瘤发展和恶性转化。以上结果表明：与对照脑组织相比， 胶质瘤组织中的IKKε异常上调，在不同分化程度的胶质瘤组织中IKKε蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。综上所述，胶质瘤细胞IKKε表达上调且其表达程度与胶质瘤恶性程度成正相关，提示IKKε可作为胶质瘤发展及判断预后的指标之一，可能与人脑胶质瘤的发生及恶性进展有关。

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The expression and significance of IKKε gene in Human gliomas.

LIHuibing，YU Kai，ZHANG Anling，WANG Kun，WAN Guangxiu，KANG Chunsheng，HUANG Qiang.Department of Neurosurgery，Tianjin Medical University General Hospital and Laboratory of Neuro-Oncology，Tianjin Neurological Institute， No.154 Anshan Road， Heping Distrct， Tianjin 300052， China.Tel： 022－60814468.

ObjectiveTo investigate the expression and significance of IKKε in humam gliomas of different grades. M ethods Fifty-one fresh glioma specimens with a defined histological grade including 24 ofⅠ～Ⅱ grade glioma， 27 ofⅢ～Ⅳ grade glioma were collected and 7 normal brain tissue samples served as a control.real-time PCR and Western blotwere used to detect IKKεmRNA and protein expression， respectively.Immunohistochemical staining was used to detect the cellular localization of IKKε.Results IKKεmRNA and protein expression levels were significantly higher in human glioma than in normal brain tissue.IKKεmRNA and protein levels were significantly higher inⅢ～Ⅳgrade glioma group than in Ⅰ～Ⅱgrade group（t＝ 21.587，P＜ 0.05）.Western blot showed no expression of IKKε in control group （6／7）， moderate／high expression of IKKε in 3／24 ofⅠ～Ⅱ grade glioma and 23／27 ofⅢ～Ⅳ grade glioma.Immunohistochemical staining showed the IKKεimmunoreactivitymainly in the cytoplasm.In addition， IKKε expression was positively correlated with the grade of human glioma （r＝ 0.513，P＜ 0.05）.Conclusion ThemRNA and protein expression levels of IKKεis significantly high in human glioma which is positively associated with the grade of glioma.Therefore， IKKεmay be related to the occurrence andmalignant development of human glioma.

Glioma IKKε Pathological grade

（E-mail：Huang Qiang209＠yahoo.com.cn）

R651

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.001

☆ 国家自然科学基金（编号：81172405）资助

* 天津医科大学总医院神经外科，天津市神经病学研究所神经

肿瘤研究室（天津 300052）

2011－12－12）

甘章平）

·论 著·