脑脊液单核细胞内ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值☆

杨笑 郭旻 谢鹏

脑脊液单核细胞内ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值☆

杨笑*郭旻△谢鹏*

目的 通过检测结核性脑膜炎（tuberculousmeningitis，TBM）患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6（early secreted antigenic target，ESAT-6），探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法 将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞学、抗酸染色检查，同时用免疫荧光细胞化学染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6。结果 在临床诊断TBM的42例患者中有38例脑脊液单核细胞中检出ESAT-6，47例对照组中检出4例。TBM组ESAT-6的检出率明显高于对照组（P＜0.05）。该方法诊断TBM的敏感性为90.48%，特异性为91.49%。约登指数达到0.82。结论 检测脑脊液单核细胞内结核特异性抗原ESAT-6用于诊断TBM，具有灵敏度、特异度高的特点，而且简单易行，有望成为诊断TBM的一种新的辅助方法。

结核性脑膜炎 脑脊液 早期分泌抗原靶蛋白6

结核性脑膜炎（tuberculousmeningitis，TBM）是结核分枝杆菌引起的脑膜和脊髓膜的非化脓性炎症性疾病，是中枢神经系统感染的常见类型［1］。TBM具有很高的致死与致残率，而早期诊断、及时治疗是降低病死率、病残率的关键。ESAT-6是从结核分枝杆菌中分离纯化出的早期分泌性抗原靶蛋白6，其具有较强的细胞与体液免疫活性，且仅存在于致病性分枝杆菌中，故作为结核菌检测的靶抗原具有良好的敏感性与特异性。本实验使用免疫荧光细胞化学染色法对TBM患者脑脊液单核细胞内的ESAT-6进行检测，试图为TBM的实验室诊断提供一种有效的方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 TBM 组 选择 2007年 3月年至 2011年 2月于宁夏医科大学附属医院神经内科住院的符合下述诊断标准的临床确诊TBM的病例42例，其中男22例，女20例，年龄16～72岁，平均年龄（39.14 ± 19.54）岁 ，入院前均未接受抗结核治疗。发病至入院进行正规抗结核治疗的天数是7 d～43 d，平均（23.43 ± 12.35） d。 其中单纯 TBM23 例，合并颅外结核者19例（陈旧性肺结核10例，血型播散性肺结核5例，脊椎结核2例）。42例行头颅CT及或MR检查，35例异常，其中轻度梗阻性脑积水30例，脑肿胀3例，脑梗死1例，脑膜、脑基底池明显强化的8例。所有病例在临床确诊后即予以正规四联抗结核治疗。TBM的临床诊断标准参考 Ahuja［2］的临床诊断标准，包括：①临床表现有发热、头痛、呕吐，脑膜刺激征或伴有局灶性神经损害；②脑脊液检查显示细胞数增加，蛋白升高，糖和氯化物降低，阿利新兰染色未见隐球菌；③脑CT或MRI检查存在脑基底池渗出或脑积水或梗死灶等表现；④存在颅外结核如肺结核；⑤抗结核治疗有效；⑥除外其他神经科疾病。

1.1.2 对照组 均来自2008年10月至2011年2月宁夏医科大学附属医院神经内科的非TBM颅内感染的住院病例，共47例，男24例，女23例，年龄 17～ 66 岁，平均年龄（36.67 ± 16.67）岁。 其中化脓性脑膜炎25例，设为对照组1，病毒性脑膜炎22例，设为对照组2。非TBM患者诊断标准：参考人民卫生出版社第六版《神经病学》教科书［1］。

1.2 研究方法

1.2.1 脑脊液细胞学检查 FCSⅣ型微型脑脊液细胞玻片离心沉淀器（ThermoFisher生产），生化检查及浓缩集菌抗酸染色涂片。

1.2.2 脑脊液细胞制片和保存

1.2.3 ESAT-6免疫荧光细胞化学染色 ①取出玻片梯度复温；②0.01 M PBS震荡漂洗3次，每次5 min，晾干；③0.3%tritonX-100 溶液 50 μL 透膜10min，0.01M PBS 震荡漂洗 3 次，每次 5min，晾干；④玻片上加入10%正常山羊血清100μL封闭，置湿盒内室温 30 min，0.01 M PBS震荡漂洗3次，每次5 min，晾干；⑤加入一抗小鼠抗人ESAT-6单克隆抗体 （购自美国Orbigen公司）50μL，稀释度1∶200，以PBS缓冲液替代一抗为阴性对照，置湿盒内37℃温箱孵育1 h，4℃过夜，取出后 37℃ 温箱复温 30min，0.01 M PBS震荡漂洗3次，每次 5 min，晾干；（以下所有步骤都避光）；⑥加入荧光二抗FITC-兔抗鼠多克隆抗体（购自美国 Orbigen 公司）50 μL，稀释度为 1∶40，置湿盒内37℃温箱孵育 1 h，0.01M PBS 震荡漂洗 3 次，每次5min，晾干；⑦玻片上加入10%正常山羊血清100 μL 封闭，置湿盒内室温 30min，0.01M PBS 震荡漂洗3次，每次5min，晾干；⑧立即用95%甘油封片待检。

1.2.4 荧光显微镜观察 脑脊液图文分析仪（MCDS-2020重庆）采图判读结果，单核细胞胞浆呈绿色荧光为阳性，单核细胞胞浆呈暗淡浅绿为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学分析，各项检测结果以±s记录。率的比较用χ2检验，检验水准 α ＝ 0.05。

2 结果

2.1 脑脊液细胞学结果

TBM组细胞学全部呈混合细胞反应，对照组1多呈以中性粒细胞为主的混合细胞反应，两者细胞比例差异有统计学意义，P＜0.05。对照组2则以淋巴细胞反应为主，并与TBM组及对照组1差异有统计学意义，P ＜ 0.05（见表 1）。

2.2 脑脊液生化结果

TBM组与对照组1中蛋白均明显升高，二者无统计学差异，而对照组2仅轻度升高。TBM与对照组1中糖、氯化物均降低，TBM组降低更明显，但二者比较无统计学差异。对照组2糖与氯化物均在正常范围（见表2）。

表1 脑脊液细胞学结果

表2 脑脊液生化结果

2.3 脑脊液抗酸染色结果 42例TBM患者抗酸染色阳性的有6例。对照组1与对照组2均阴性。

2.4 单核细胞内ESAT-6荧光免疫染色检测结果

TBM组42例中有38例单核细胞内的ESAT-6呈现阳性（见图1、表3），包括治疗前与治疗后的TBM患者。对照组1中例有4例检测阳性。对照组2全部阴性（见图2）。

表3 ESAT-6检测结果

图1 ESAT-6阳性染色的脑脊液单核细胞图2 ESAT-6阴性染色的脑脊液单核细胞与淋巴细胞

3 讨论

TBM是严重的肺外结核病，因为在临床表现、脑脊液及影像学检查等方面无明显特异性表现，故而一直以来早期诊断困难，使患者往往贻误治疗时机，导致较高的病死率、致残率［3－4］。文献报道，TBM 的误诊率高达 50.73%［5］。

结 核 分 枝 杆 菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB）是胞内寄生菌，机体受到MTB感染后，其首先被单核巨噬细胞吞噬，故而单核巨噬细胞内的结核抗原检测可以作为MTB存在的直接证据。ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原靶，是从MTB短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白，在感染的单核细胞内生长时，ESAT-6蛋白表达明显提高［6］，因此检测单核细胞内ESAT-6具有更好的敏感性。ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中，而BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失［7］，因此，检测ESAT-6不会因为卡介苗接种和环境中的非致病性分枝杆菌感染而出现假阳性，具有较高的特异性。何俊瑛等［8］用免疫组织化学法对TBM患者进行了脑脊液单核细胞内ESAT-6的检测，发现其灵敏度为70%而特异度达到95%。

本实验中TBM组42例患者38例脑脊液单核细胞内ESAT-6检测呈阳性反应，其中9例持续检测，此9例中有6例于治疗前呈阳性反应，正规四联抗结核治疗1个月后转阴，说明早期检测及治疗前检测阳性率更高，因为随着治疗的进展，单核细胞内结核杆菌被杀灭、降解，细胞染色亦转阴，而另外3例则治疗2月后仍持续阳性，3例TBM患者临床亦表现为病情重，病程迁延，显示一定的耐药性，提示脑脊液单核细胞内结核抗原的检测具有一定判断疗效及转归的作用。TBM组有4例呈阴性反应，考虑可能与单核细胞比例较少及抗原量少有一定的关系。通常认为结核杆菌为胞内寄生菌，进入脑脊液中即被单核细胞吞噬，理论上不应有单核细胞外的其它细胞染色，但本实验中TBM组患者脑脊液除单核细胞强染色外，淋巴细胞及中性粒细胞均有轻度染色，考虑可能与淋巴细胞、中性粒细胞在疾病发展中尤其是疾病早期较弱的吞噬作用有关。对照组1的25例中有4例呈阳性染色，治疗后1周复查3例转阴，1例仍呈阳性，此4例均否认结核病史，经抗细菌感染治疗后病情迅速稳定好转，其单核细胞内ESAT-6染色阳性考虑可能与MTB与属内外某些微生物有共同的抗原故而发生交叉免疫。对照组2中22例全部阴性，提示脑脊液单核细胞内ESAT-6具有较好的特异性。此方法诊断TBM 敏感性为90.48%，特异性为91.49%。

总之，本实验利用结核分枝杆菌胞内寄生的特点，运用免疫荧光细胞化学染色法对TBM及非TBM颅内感染患者脑脊液单核细胞内ESAT-6进行检测，结果显示其具有较高的敏感性与特异性，对于TBM的诊断具有一定的价值。

TBM组与对照组1在脑脊液白细胞总数、细胞比例方面虽存在统计学差异，但数据重叠较多，临床无法依此鉴别两者。而葡萄糖、氯离子、蛋白水平等方面均无统计学差异，此两组指标与对照组2分别比较均有统计学差异。说明依靠脑脊液细胞学及生化检查较易区别细菌性和病毒性颅内感染，但难以鉴别TBM与非特异性细菌感染。本实验中脑脊液涂片抗酸染色检查显示了较低的敏感性，提示其不能很好地满足临床需要。

［1］ 贾建平，崔丽英，王伟，等.神经病学（第六版）［M］.北京：人民卫生出版社， 2010：240－242.

［2］Ahuja GK， Mohan KK， Prasad K， et al.Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation［J］.Tuber Lung Dis， 1994，75（2）：149－152.

［3］ 武俊平，吴琦.结核性脑膜炎诊断与治疗研究进展［J］.国外医学呼吸系统分册， 2005，25（1）：49－51.

［4］ 丰岩清，国宁.不典型的结核性脑膜脑炎［J］.中国神经精神疾病杂志， 2009，32（5）：479－483.

［5］ 李玲，尤志君，黄如训，等.中枢神经系统结核误诊分析［J］.中国神经精神疾病杂志， 2001，27（3）：189－192.

［6］Lee BY， Horwitz MA.Identification of macrophage and stressinduced proteins of Mycobacterium tuberculosis［J］.Clin Invest， 1995，96（1）：245－249.

［7］Arend SM， deHaas P， Leyten E， et al.ESAT-6 and CFP-10 inclinical versus environmental isolates of Mycobacterium kansasii［J］.InfectDis， 2005，191（8）：1301－1310.

［8］ 何俊瑛，刘士甫.脑脊液单核细胞内ESAT-6检测对结核性脑膜炎的诊断意义［J］.脑与神经疾病杂志， 2010，18（3）：209－211.

The value of ESAT-6 in themonocytes of CSF in diagnosis of tuberculousmeningitis.YANG Xiao， GUOMin，XIEPeng.Neurology Research Center of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China.Tel： 023－68485490.

ObjectiveEvaluate the value of ESAT-6 in diagnosis of tubercularmeningitis by detecting ESAT-6 in the monocytes of CSF.M ethods 42 patients with tuberculous meningitis were chosen as TBM group and 47 patients with non-tuberculous intracranial infections as control group.All patients in both groups had routine biochemical test， cytology examination （May-Grunwald Giemsa stain） and acid fast stain tests， while immunofluorescence cytochemical staining was used to detect ESAT-6 in the monocytes of CSF. Results In TBM group， 38 patients showed positive ESAT-6 in themonocytes of CSF， while only 4 showed positive ESAT-6 in the control group.The positive rate of ESAT-6 in TBM group was significantly higher than that in the control group （P ＜ 0.05）， its sensitivity was 90.48%， and specificity was 91.49%.Youden index is 0.82.Conclusions The ESAT-6 detection， with high sensitivity and specificity， is a simple and feasiblemethod in diagnosis of tuberculousmeningitis.

Tuberculous meningitis （TBM） Cerebrospinal fluid （CSF） Early secreted antigenic target（ESAT-6）

R529.3

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.003

☆ 宁夏自然科学基金项目（编号：NZ10150）

* 重庆医科大学附属第一医院，重庆医科大学神经科学研究中心（重庆 400016）

△ 宁夏医科大学第二附属医院

（E-mail：xiepeng58＠21cn.com）

2011－07－16）

李立）

·论 著·