水貂犬瘟热动物模型的建立

王胜乐，王铁成，冯 娜，李元果，于志君，丁 洁，许薇薇，忻 悦，岳秀芳，王 铮，郑学星，杨松涛，黄 耕，赵永坤，高玉伟，夏咸柱

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130062；2.中国军事医学院军事兽医研究所，长春 130062；

3.吉林省人畜共患病预防与控制重点实验室，长春 130062)

水貂犬瘟热动物模型的建立

王胜乐1，2，3，王铁成2，3，冯 娜1，2，3，李元果2，于志君2，丁 洁2，许薇薇2，忻 悦2，岳秀芳2，王 铮2，郑学星2，3，杨松涛2，3，黄 耕2，3，赵永坤2，3，高玉伟2，3，夏咸柱2，3

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130062；2.中国军事医学院军事兽医研究所，长春 130062；

3.吉林省人畜共患病预防与控制重点实验室，长春 130062)

目的 建立水貂犬瘟热动物模型，并利用水貂犬瘟热模型评价不同犬瘟热强毒株的毒力，为水貂犬瘟热病毒疫苗的研究奠定基础。方法 从猴、藏獒、犬的病料中分离犬瘟热病毒，测定犬瘟热病毒的毒力，并进行传代培养。利用犬的犬瘟热动物模型筛选稳定的犬瘟热强毒株，进行水貂犬瘟热动物模型的建立及其毒力评估。结果 筛选出了稳定的犬瘟热强毒株并进行了家犬动物实验，同时表现出了强烈的临床症状，并利用不同的代次毒进行了犬瘟热动物模型的建立。结论 成功建立了犬瘟热动物模型并对不同来源的犬瘟热病毒毒力进行了评估。

水貂；模型，动物；毒力评估；大瘟热病毒

犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属RNA病毒成员。水貂犬瘟热又称貂瘟，是一种严重危害水貂养殖的烈性传染性疾病。水貂犬瘟热呈现慢性或急性经过，慢性型的病程通常为2～4周，急性型的病程为3～10d，主要表现为眼和鼻内排出粘稠分泌物，有时会阻塞眼、鼻，体温升高至40℃以上。当貂群中感染犬瘟热病毒，经3～4周即可在貂群中广泛传播，症状严重，死亡率较高，有时可达80%～90%，对2～4月龄幼貂感染更为严重［1］。随着水貂做为一种经济动物在我国集约化养殖范围越来越广，规模逐渐扩大，一旦在貂场发生该病感染，很难治愈，同时发生犬瘟热时会继发细菌感染，为本病的治疗又带来了巨大困难，会给貂场造成了严重的经济损失［2］。

应用疫苗可以较好的的预防犬瘟热病毒［3］，犬瘟热疫苗在犬等动物中取得较为满意的预防效果，但在水貂中因缺少水貂动物模型［4］，犬瘟热疫苗在水貂中起到预防作用还不完全明确，为此，本试验通过建立水貂犬瘟热动物模型，并对毒力进行评估，为水貂犬瘟热疫苗的研究提供理论和技术依据。

1 材料和方法

1.1 细胞、毒株及试验动物

细胞、毒株：Dog-DST细胞，犬瘟热强毒株：猴源犬瘟热(monkey-CDV)、藏獒源犬瘟热(ZACDV)、黑川犬源犬瘟热病毒(HC-CDV)由本实验室分离、鉴定和保存。试验动物：2～3月龄水貂 购自长春某水貂场。

1.2 主要试剂

抗CDV单克隆抗体 6H8由本实验室制备；DMEM(HyClone)；G418(Sigma公司)；新生犊牛血清(长春西诺生物科技有限公司)。青霉素、链霉素(华联医药有限公司)；犬瘟热诊断试剂盒，购自韩国BIT产品。

1.3 主要仪器设备

HEMAVET 950FS型血液五分类分析仪；电子显微镜(JEM-1200EXⅡ型，日本)；XDS-1B倒置显微镜(中国上海)；CO2细胞培养箱(Thermo)；高速冷冻离心机(Centrifuge 5418，Eppendorf)；生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；电子天秤(Sartorious)；Tissuelyser II 型 组 织 研 磨 器(QIAGEN)；制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；冰箱(Siemens)。

1.4 试验动物的选择

试验前分别采集水貂血液，分离血清，并进行初步处理(各血清样本56℃灭活30min，分别加青、链霉素4℃ 12h)，进行中和试验［5-6］，选用血清犬瘟热中和抗体效价小于1∶8的水貂进行试验。

1.5 犬瘟热毒株毒力测定

将分离培养稳定的犬瘟热病毒用无血清的细胞培养液按10倍连续稀释10-1、10-2……10-6，每个稀释度接种4个孔，每孔0.1mL，再于各孔中加入50μL Vero-DST细胞悬液，最后2列加细胞培养液，作为Vero细胞对照。置于5%CO2培养箱37℃培养，记录细胞出现CPE，5d后，按Reed-Muench方法计算各毒株的TCID50，选病毒滴度为104TCID50/m L以上的犬瘟热毒株进行试验［7］。

1.6 犬瘟热病毒对水貂的攻毒试验及临床症状评分标准

犬瘟热病毒对水貂的攻毒试验：为检测犬瘟热各毒株对水貂感染情况，进行攻毒试验，试验共分4组，第1组为对照组，其他各组为犬瘟热攻毒组，见表1。隔天采血，每天测量体温、收集粪便、鼻洗液、咽拭子及眼拭子，并用犬瘟热诊断试剂盒检测排毒情况［8］。

（3）环境执法监测存在部门冲突。在县级基层，政府并未建立专门的环境执法监测部门，主要以地方农业部门、环保部门等多个部门为主体实施。在此之下，环境执法检测浪费了过多行政资源，并且容易造成职能冲突，部门之间存在责任推卸，对环境执法造成负面影响。

临床症状评分标准：主要依据水貂临床症状等制定评分标准，评分高说明临床症状明显(表2)。

表1 水貂犬瘟热攻毒方法试验设计Tab.1 The method of CDV infect the mink

表2 水貂感染犬瘟热临床评分标准Tab.2 The standard score of the mink infected CDV

1.7 水貂的血项检测

攻毒后从第0天隔日采血，并用抗凝管采集各组水貂血液，用HEMAVET 950FS型血液五分类分析仪对每只貂血液进行血相分析。

1.8 水貂各脏器病理组织切片制备

将即将死亡的水貂麻醉后，取肺、脾、肠等脏器于组织固定液中，选择适宜时间制备石蜡切片。把各脏器修成厚度小于2mm的小组织块，放入组织处理标准盒，流水冲洗24h后，利用生物组织自动脱水机进行脱水、透明和浸蜡；石蜡包埋机包埋成标准蜡块，每个蜡块切4μL厚的连续切片4片，进行编号，烘干后4℃保存.

2 结果

2.1 攻毒后水貂排毒情况

犬瘟热各毒病感染水貂后排毒时间并不相同，从收集各部分样本检测结果可初步判定各毒株在水貂各器官排毒情况也不相同，第4天开始，攻ZACDV的水貂，可以在其肛拭子、鼻洗液里检测到犬瘟热病毒，而Monkey-CDV毒株在肛拭子、鼻洗液里从第6天开始排毒，HC-CDV从第6天的肛拭子、鼻洗液开始检测到犬瘟热病毒。

表3 第4天犬瘟热病毒攻击水貂结果Tab.3 The result of the mink infected CDV at the 4th day

2.2 感染犬瘟热病毒各组水貂临床评分结果

攻毒后第20天计算水貂临床总体评分情况。感染藏獒源犬瘟热病毒的水貂临床症状特别明显；感染猴源犬瘟热病毒的水貂临床症状较为明显；感染犬源犬瘟热病毒的水貂没有表现出临床症状(表4).

表4 犬瘟热病毒攻击水貂20天后总体评分结果Tab.4 The overall score of the mink effected CDV after 20days

2.3 水貂感染犬瘟热病毒后血项变化

水貂感染犬瘟热后单核细胞、淋巴细胞和白细胞在感染后10～12d均明显下降(图1、2、3)。

2.4 水貂感染犬瘟热后体温变化

水貂感染犬瘟热病毒后体温不同程度呈现双相热变化(图4、5、6)。

2.5 感染犬瘟热病毒组织病理变化

感染犬瘟热病毒水貂肺脏表现为间质性肺炎，肺泡间隔增厚，肠壁内毛细血管扩张，肺泡有渗出物，肺细胞大量增生(彩插3图7)；小肠绒毛短缩，上皮细胞脱落，黏膜固层毛血管扩张、充血(彩插3图8)。

水貂犬瘟热目前已成为影响我国水貂养殖业的重要传染性疾病，开始时在貂场小范围传播，继而在整个水貂场流行，病死率高。建立水貂犬瘟热动物模型不仅有助于水貂犬瘟热病毒的研究，而且能够为研制水貂犬瘟热疫苗提供模型［10］。许多科研人员进行了雪貂犬瘟热动物模型的建立，但是对于水貂犬瘟热动物模型的研究还较少。

图1 感染犬瘟热后水貂单核细胞变化Fig.1 The infected CDV mink monocytes change

图2 感染犬瘟热后水貂淋巴细胞变化Fig.2 The infected CDV mink lymphocytes change

图3 感染犬瘟热后水貂白细胞变化Fig.3 The infected CDV mink WBC change

3 讨论

图4 水貂感染藏獒源犬瘟热后体温变化1-4号为攻毒水貂，5号为对照Fig.4 The body temperature changes of the m ink infected Tibetan mastiff CDV

图5 水貂感染猴源犬瘟热后体温变化1-4号为攻毒水貂，5号为对照Fig.5 The body temperature changes of the mink infected monkey CDV

图6 水貂感染犬源犬瘟热后体温变化1-4号为攻毒水貂，5号为对照Fig.6 The body temperature changes of the m ink infected canine CDV

本试验中应用稳定的藏獒源犬瘟热病毒、猴源犬瘟热病毒和犬源犬瘟热病毒对水貂进行了攻毒试验，确定了建立水貂犬瘟热动物模型的犬瘟热毒株。藏獒源犬瘟热对水貂有较强的致病性，水貂临床症状明显通常表现为眼、鼻有粘稠分泌物，有的水貂眼被分泌物封闭，粪便呈黄绿色粘稠状，体温呈现双相热，有的水貂发生神经症状，食欲减退，病程为2-4周，最终因机体器官功能衰竭死亡。当水貂感染犬瘟热病毒后的2周左右白细胞下降明显，淋巴细胞和单核细胞也有不同程度的降低。病理组织切片表明，当水貂感染犬瘟热病毒后期，肺内充满炎性细胞和粘性分泌物，对小肠粘膜也有很大的损伤，常出现肠粘膜脱落，肠绒毛坏死等，这为临床诊断水貂犬瘟热病毒提供参考。

在水貂犬瘟热动物模型建立过程中，试验重复了2次，均得到相同结果，建立的水貂犬瘟热模型较为稳定，这为水貂犬瘟热疫苗研制，药物开发均有较好研究基础，同时建立的水貂犬瘟热模型具有较好的应用前景。

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The M ink M odel Establishm ent of Canine Distem per Virus

WANG Sheng-le1，2，3，WANG Tie-cheng2，3，FENG Na1，2，3，LI Yuan-guo2，YU Zhi-jun2，DING Jie2，XU Wei-wei2，XIN Yue2，YUE Xiu-fang2，WANG Zheng2，ZHENG Xue-xing2，3，YANG Song-tao2，3，HUANG Geng2，3，GAO Yu-wei2，3，XIA Xian-zhu2，3
(1.Jilin Agricultural university Institute of Animal Science；Changchun 130062，China；
2.Military Veterinary institute，Academy of Military Medical Science of PLA，Changchun 130062，China；3.Institute of Military Veterinary，AMMS，Key laboratory of Jilin province for zoonosis
prevention and control，Changchun 130062，China)

Ob jective To establish a mink model of canine distemper virus，and different canine distemper virulent strain virulence was evaluated by the mink animal model for laying the foundation for the study of the canine distemper virus.M ethods Different canine distemper viruses were separated from specimens，cell-cultured，passaged and determined virulence of CDV.And we compared the virulence of different generation virulent strains，stable virulent strains were used for establishing mink canine distemper animal model and evaluated their virulence.Resu lts We screened 3canine distemper virulent strains and made dog animal experiments，the three viruses infected dogs and they showed a strong clinical symptoms，and mink animal model was established using different generations.Conclusion we successfully established the canine distemper animal model and evaluated virulence of CDV.

Mink；Model，animal；Virulence evaluation；Canine distemper virus

973农业生物安全项目(20120001)。

王胜乐，男，硕士；研究领域：主要从事动物病毒学研究。E-mail：wangshengle19850919@gmail.com。

夏咸柱，E-mail：xia_xzh@yahoo.com.cn；高玉伟，E-mail：gywtext@yahoo.com.cn。

R332

A

1671-7856(2012)11-0054-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.0011.0012

2012-10-19