利多卡因对体外培养人关节软骨细胞凋亡的影响

李化光 刘 华 孙 洁 杨新明 张林西 (河北北方学院附属第一医院骨科，河北 张家口 075000)

利多卡因对体外培养人关节软骨细胞凋亡的影响

李化光 刘 华1孙 洁 杨新明 张林西1(河北北方学院附属第一医院骨科，河北 张家口 075000)

目的 通过检测10 mg/ml和20 mg/ml利多卡因干预后体外培养人关节软骨细胞凋亡率的变化，探讨短时间利多卡因对正常软骨细胞是否有毒害作用。方法 正常人关节软骨组织进行消化培养获取软骨细胞，分别用PBS、10 mg/ml利多卡因和20 mg/ml利多卡因处理24 h，然后利用流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率。结果 10 mg/ml和20 mg/ml利多卡因作用后都可使体外培养的软骨细胞凋亡率明显升高，同10 mg/ml利多卡因相比，20 mg/ml更能促进软骨细胞凋亡。结论 利多卡因能够导致体外培养关节软骨细胞凋亡的增加，关节内注射利多卡因有可能加速骨性关节炎发生，临床应慎用。

利多卡因;软骨细胞;细胞凋亡

骨性关节炎(OA)治疗一般首选保守治疗，包括口服药物治疗(主要是非甾体类解热镇痛药和保护关节软骨药物)，肢体功能锻炼治疗以及关节内注射药物治疗。局麻药在临床上常用来关节内注射缓解OA患者的关节疼痛症状，另外许多关节外科医生在关节镜手术后也常规关节内注射局麻药缓解病人术后关节疼痛〔1〕;但是最近Chu等〔2〕报道0.5%布比卡因能够使体外培养牛关节软骨细胞凋亡增加，这提示局麻药可能对软骨细胞产生毒害作用，但许多局麻药仍在临床上大量使用，特别是关节内注射利多卡因起效快，费用低廉，故仍在临床广泛应用，但利多卡因对体外培养关节软骨凋亡的研究罕见，本实验应用不同浓度利多卡因处理体外培养的人关节软骨细胞，然后检测软骨细胞凋亡的变化，探讨利多卡因是否能够增加软骨细胞凋亡，为临床合理应用药物治疗OA提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖培养液，Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司)凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。美国FACSAria流式细胞仪。关节软骨标本取自无OA病史接受截肢手术患者的股骨内侧髁关节软骨7例，男6例，女1例，年龄25～36岁。

1.2 实验方法

1.2.1 原代软骨细胞的分离 成年人关节软骨细胞(AHAC)的分离培养：无菌取右下肢毁损伤患者截肢右股骨髁关节软骨，剪碎，加人10倍体积0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃搅拌消化3～4 h，离心，沉淀用含20%FBS软骨细胞培养基稀释，按2×105/ml接种到 50 ml培养瓶中，37℃、5%CO2培养，常规按 1∶2传代培养。传2代细胞用于实验。

1.2.2 分组 传代后的软骨细胞被分为3组：第一组为对照组，向培养皿内软骨细胞加入1 ml PBS，第二组加入1 ml利多卡因(10 mg/ml)，第三组加入1 ml利多卡因(20 mg/ml)，分别作用24 h，收集细胞，然后按照试剂盒说明将各组细胞染色标记，应用流式细胞仪分别检测细胞凋亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

同对照组相比，10 mg/ml和20 mg/ml利多卡因作用后体外培养软骨细胞凋亡率明显增加〔(15.07±1.21)%、(19.74±2.70)%vs(1.62±0.47)%，P＜0.05〕，PBS干预24 h后测定软骨细胞凋亡率仅为1.5%，而10 mg/ml利多卡因作用24 h后软骨细胞凋亡率为15%，20 mg/ml利多卡因干预24 h后软骨细胞凋亡率为19%。

3 讨论

联合应用关节内注射局麻药和糖皮质激素类药物一般能够迅速减轻OA患者疼痛症状，改善生活质量，其不足之处是持续时间较短，一般不超过3个月，此外长期应用糖皮质激素类药物还可导致关节软骨早期发生蜕变，导致OA，故临床上对应用糖皮质激素类药物目前已经非常谨慎，但对应用局麻药是否对关节软骨有毒害作用的研究还非常罕见，有学者研究表明局麻药对神经细胞、肌细胞等多种细胞具有细胞毒作用〔3，4〕，而通常认为细胞坏死是通过细胞膜的破裂发生的，而线粒体膜的破裂往往导致细胞发生凋亡。有学者发现细胞周围的高度脂溶性的局麻药极易到达线粒体进而导致线粒体膜的破裂，而一旦局麻药清除后细胞内线粒体膜具有自我修复倾向〔5〕，凋亡是一种高度程序化的细胞自杀行为，是机体正常发育过程中清除无用细胞的生理机制。然而凋亡也经常参与疾病的病理过程〔6〕。许多研究发现软骨细胞的凋亡与OA的病理机制有关。对分离的软骨细胞以及对软骨组织原位研究显示在OA关节软骨中发生了大量的软骨细胞凋亡〔7〕。研究表明OA患者关节软骨蜕变和凋亡存在一定相关性〔8〕。一般认为这主要是因为软骨组织自身特点导致，软骨组织中无巨噬细胞，因此软骨细胞发生凋亡后凋亡小体不能被巨噬细胞清楚，凋亡小体释放的蛋白水解酶就会对细胞外基质造成不可逆的损害，而关节软骨自我修复能力极为有限，如果大量软骨细胞发生凋亡后软骨细胞周围细胞外基质成分将大量缺失，而细胞外基质成分对维持关节软骨组织稳定性至关重要，因此，任何关节内注射后能够导致软骨细胞发生凋亡的药物将加速OA的发生。本实验发现，随着利多卡因浓度的增加，体外培养关节软骨细胞的凋亡率也随着增高。

本实验认为关节内注射局麻药治疗OA应慎重，即使应用也应小剂量、低浓度短期应用，否则有可能对关节软骨产生毒害作用，诱发OA。当然，本研究还存在一定局限性：首先，本实验检测的是体外培养关节软骨细胞的凋亡变化，而软骨细胞在消化及体外培养过程中不能全部存活，并且体外培养的悬浮细胞不能完全反应复杂、高度分化的软骨组织，所以利多卡因在体外培养细胞中的扩散同在软骨组织中的扩散也不尽相同;其次，本实验只检测了利多卡因这一临床常用的局麻药物，如果检测其他不同局麻药物，也可能会有不同结果，还需进一步确定不同浓度及作用时间的不同类型局麻药对关节软骨细胞凋亡的影响。

1 American College of Rheumatology Subcommittee on Osteoarthritis Guidelines.Recommendations for the medical management of osteoarthritis of the hip and knee：2000 update〔J〕.Arthritis Rheum，2000;43(9)：1905-15.

2 Chu CR，Izzo NJ，Papas NE，et al.In vitro exposure to 0.5%bupivacaine is cytotoxic to bovine articular chondrocytes〔J〕.Arthroscopy，2006;22(7)：693-9.

3 李琼珍.术后镇痛对免疫功能的影响〔J〕.实用医学杂志，2010;26(12)：2251-2.

4 Kim HA，Lee YJ，Seong SC.Apoptotic chondrocyte death in human osteoarthritis〔J〕.Rheumatol，2000;27(2)：455-62.

5 Blanco FJ，Guitian R，Vazquez-Martul E，et al.Osteoarthritis chondrocytes die by apoptosis：a possible pathway for osteoarthritis pathology〔J〕.Arthritis Rheum，1998;41(2)：284-9.

6 Kuhn K，D'Lima DD，Hashimoto S，et al.Cell death in cartilage〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2004;12(1)：1-16.

7 Hashimoto S，Ochs RL，Komiya S，et al.Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritis〔J〕.Arthritis Rheum，1998;41(9)：1632-8.

8 Irwin W，Fontaine E，Agnolucci L，et al.Bupivacaine myotoxicity is mediated by mitochondria〔J〕.Biol Chem，2002;277(14)：12221-7.

R684.3

〕 A 〔

1005-9202(2012)22-4952-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.045

河北省教育厅科学研究计划项目(No.Z2010224);张家口市科技局科学研究与发展指导计划(No.0801006D)

1 河北北方学院生命科学研究中心

张林西(1968-)，男，教授，硕士生导师，主要从事病理学研究。

李化光(1976-)，男，硕士，主治医师，主要从事骨外科学研究。

〔2011-10-26收稿 2012-01-12修回〕

(编辑 曹梦园)