ERK信号传导调节脑缺血再灌注中脑源性神经营养因子介导的神经保护作用

严之红 郭威早 佟 倩

(航天中心医院高干二科，北京 100049)

缺血再灌注(IR)损伤是脑血管疾病组织损害中核心病理因素之一〔1〕。研究显示，细胞外调节激酶(ERK)信号通路在IR损伤的修复机制中具有重要作用〔2〕，而脑源性神经营养因子(BDNF)对神经损伤的保护作用亦获得了明确的实验依据，并且这种保护作用的分子机制与ERK信号通路关系密切〔3〕。然而，BDNF和ERK信号通路在IR损伤中的关系目前尚不明确。本文旨在研究BDNF在IR损伤中的神经保护作用及其与ERK信号传导的关系。

1 材料与方法

1.1 IR损伤动物模型 体重250 g左右的健康雄性SD大鼠被随机分为A、B、C三组，每组6只，所有的大鼠均经历脑局灶性缺血再灌注过程。MCAO缺血再灌注参考文献〔4〕报道并作适度改良，具体操作方法:以10%(w/v)水合氯醛按400 mg/kg的剂量经腹腔注射对大鼠实施麻醉。在大鼠颈部中线由下颌至胸骨实施切口，将颈部肌肉向旁剥离以便暴露颈总动脉。将Dermalon 3-0号单纤维手术缝线末端用炽热前状态的金属片烙约1 s，使末端钝化，然后在距末端20 mm处标记。双侧颈总动脉以微型血管夹断流，在右侧颈内动脉和颈总动脉的分叉附近切口，将端头钝化处理的手术线插入，沿颈内动脉上行约20 mm，遇阻力后即停止。脑缺血状态持续45 min，然后将微型血管夹和手术缝线撤除，使再灌注保持12 h。

1.2 BDNF的应用及ERK信号通路的阻断 冷冻干燥的BDNF蛋白结晶和选择性Raf-1抑制剂均由美国国立精神卫生研究所生物标记实验室赠送。将BDNF溶于pH7.4磷酸盐缓冲液配成1μg/μl的溶液备用。将Bay 43-9006溶于二甲基亚砜(DMSO)配成5 ng/μl的溶液备用。A组大鼠在进入IR之前6 h，在每只大鼠的右脑室注射2μl pH7.4磷酸盐缓冲液;B、C两组大鼠在进入IR之前6 h，在每只大鼠的右脑室注射2.0μg BDNF。A、B两组大鼠在进入IR之前12 h，在每只大鼠的右脑室注射2μl DMSO，C组大鼠在进入IR之前12 h，在每只大鼠的右脑室注射10 ng Bay 43-9006。

1.3 脑损伤的组织化学评估 对每个大鼠按常规步骤开颅及分离脑，切除嗅球及少量顶端前额叶组织，然后切取额叶，固定48 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，每隔1 mm行额状切片并进行编号。切片经常规甲酚紫染色和显微拍照后，采用Image-Pro Plus(Media Cybernetics，v6)图像分析确定和比较脑损伤的面积〔5〕进行。脑损伤的程度以组织损失的百分比表示。

1.4 蛋白免疫印迹杂交 根据本课题组既往报道〔6〕的方法进行，针对组织特点进行了适应性改变。将约100 mg脑组织浸入1 ml冰冷的裂解缓冲液，匀浆后通过Virtis超声细胞粉碎仪进行超声剪切(设置2.0，处理1 s×10次)，然后离心5 min去除不溶性沉渣。蛋白浓度测定采用Pierce公司BCA蛋白试剂盒进行。等量的蛋白加入到8% ～16%SDS-PAGE进行电泳分离，然后电转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜上的非特异结合通过以下杂交液屏蔽。杂交液包括Tris缓冲盐水，0.1%吐温-20，5%脱脂牛奶。ERK抗体(抗 ERK 1/2，即抗 p44/p42)，磷酸化ERK抗体(抗202位苏氨酸磷酸化的ERK 1/2)购自Santa Cruz生物技术公司，实验中采用1∶500的比例稀释。次级抗体为辣根过氧化物酶耦联的抗山羊(运用于ERK1/2)或抗兔(运用于pERK1/2)抗体。免疫复合物用Amersham ECL加强型试剂盒探测。免疫印迹的定量分析采用Syngene凝胶建档及分析系统进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5软件进行ANOVA，Tukey Post-Hoc及t检验。

2 结果

2.1 BDNF对于IR损伤具有明显的保护作用 在单纯IR损伤组(A组)，脑组织损伤面为(16.48±5.72)%;在使用BDNF预处理的情况下(B组)，脑组织损伤面为(6.32±3.08)%，较A组显著减少 (P=0.039);与未使用BDNF的A组比较，损伤面积减少到原来的38.3%。然而，在使用BDNF的同时使用选择性Raf-1抑制剂(C组)，则BDNF的神经保护作用被明显稀释，脑组织损伤面积又回升到(11.40±3.28)%，与A组已经不构成显著差别。

2.2 Bay 43-9006抑制ERK通路的活性水平 B组和C组使用了相同剂量的BDNF预治疗，但C组同时使用了选择性Raf-1抑制剂Bay 43-9006。因为Raf-1是ERK信号通路中的重要信号分子，因此，以磷酸化水平所代表的ERK信号传导活性水平显著降低。ERK1(p44)的磷酸化水平由B组的(51.73±13.06)%下降至C组的(25.34±12.12)%，具有高显著性差异(P=0.008 4)。ERK2(p42)的磷酸化水平由B组的(81.16±17.03)%下降至C组的(50.42±14.56)%，差异亦具有显著性(P=0.029)。

3 讨论

因既往研究显示BDNF的神经保护作用经由ERK信号传导通路介导〔7〕，因此在本文观察到BDNF对IR损伤的保护作用之后，在机制方面聚焦到ERK信号传导。与笔者的理论预计一致，当ERK信号通路上的Raf-1这一关键信号分子被Bay 43-9006选择性抑制后，BDNF的神经保护作用也被显著抵消。综合以上观察结果，笔者推论，在脑IR过程中，ERK信号传导介导了BDNF的神经保护。但这一推论仍然只能作为一个具有局限性的初步结论，是一个深入研究的起点。Bay 43-9006的生物学活性并非仅限于Raf-1信号分子的抑制〔8〕，因此目前的研究结果需要谨慎解释。

IR损伤的病理机制广泛而复杂，在分子病理水平上尤其如此，这其中涉及多个信号传导通路、细胞因子和神经递质等〔9〕。在脑IR损伤中，ERK的激活具有促进DNA修复、抑制细胞凋亡、保护神经元的作用〔10〕，具有潜在的临床运用价值。其实，对ERK通路的调节不仅有BDNF，还有其他很多的分子、受体、细胞因子、激素等，甚至一些心血管药物也同样具有ERK的调节作用〔11〕。积极利用这些调节途径，促进IR损伤的修复和相应疾病的预后，会对治疗诸如缺血性脑中风等心脑血管疾病具有积极的促进作用。

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