烟草突变体筛选与鉴定方法篇：3.烟草突变体的TILLING筛选与功能鉴定

李凤霞

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

TILLING（targeting induced local lesions in genomes,定向诱导基因组局部突变）是利用单核苷酸多态性筛选突变体的一种全新反向遗传学方法，该方法首先通过化学诱变产生高频率点突变，再利用点突变筛选技术如毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）、琼脂糖电泳（agarose gel electrophoresis,AGE）、高分辨熔解曲线（high-resolution melting,HRM）以及高通量测序技术（next-generation sequencing）等方法将点突变筛选出来，具有高通量、低成本的技术特点。随着烟草全基因组测序的完成，TILLING在烟草功能基因组学中的重要价值也越发体现出来。

1 TILLING检测的分析群体构建

适度突变是构建优质突变体群体一个极为重要的参数，一般要求诱变种子M1代萌发率在30%～80%[1]。M2代群体一般采用M1代单粒传法构建。

TILLING检测需要一定的群体规模，所需群体大小与该植物的倍性有很大关系，由于多倍体能忍耐更高水平的突变剂量，多倍体的突变频率要显著高于二倍体，如二倍体植物拟南芥、水稻、玉米的突变频率分别为1/170 kb、1/500 kb、1/485 kb，而多倍体植物普通小麦突变频率1/24 kb，普通烟草约为1/66 kb，因此要使基因组中95%以上的基因都有突变信息，多倍体植物如普通小麦TILLING检测群体很少超过5000株系，而二倍体的群体经常需要上万株系[2]。

2 目标基因的生物信息学

TILLING 技术作为一种全新的反向遗传学方法，在应用于拟南芥突变体筛选时可达到一年内筛选超过100个基因，获得1000多个不同拟南芥等位变异体，这种高效率得益于拟南芥较为简单的基因组结构以及拟南芥全基因测序的完成。

由于植物基因组信息庞大，对目标基因的挑选至关重要，这就需要通过生物信息学的手段挑选目标基因。其一，基因冗余现象在真核生物特别是多倍体植物中非常普遍。对于冗余的基因，往往需要同时筛选相似性较高的几个或几十个基因。其二，每个基因结构和大小并不相同，基因和基因之间互成网络，相互依赖关系紧密，往往需要挑选转录调控因子作为优先的目标筛选基因，因为它可调节几个或几十个基因的表达。其三，由于每个基因的结构不同，而 TILLING片段长度和成本的限制，常常挑选较保守的区域或功能结构域作为筛选目标片段。

3 引物设计

在 TILLING检测中，引物设计的质量直接影响突变筛选结果，所以在确立所要筛选的目标区段后，如何根据目标序列设计引物就成为TILLING的一个重要方面。一般引物设计在CODDLE（codons optimized to discover deleterious）程序中进行，CODDLE能识别各种形式的序列信息，并能根据输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区模型，当1000 bp被选中后，系统会根据最有可能突变成高频率终止密码子的区域或进化保守区域设计引物。

4 突变体检测

基因片段中的点突变检测一般通过以下步骤进行：（1）突变群体基因组DNA分离、DNA样品定量分析及浓度均一化、构建不同混样倍数的DNA池；（2）PCR扩增、异源双链重组；（3）CELI 酶切异源双链核酸分子；（4）电泳检测，检测手段可通过产生真实电泳图谱的 LICOR4300遗传分析工作站进行，也可通过自动化程度较高的毛细管电泳系统进行；（5）采取相同的方法从突变池中筛选突变个体；（6）突变个体PCR产物的测序验证。

5 突变基因功能验证

一旦点突变被发现后，对引起编码蛋白功能损伤的突变就要进行表型分析。但化学诱变一般要引入大量点突变，如水稻诱变M2代群体中，每个突变体的突变密度约为1075个点突变，普通烟草约为68 000个点突变，这使得表型分析变得相对困难，尤其对功能未知的基因。如果突变体有表型变化，需要以下三种方法进行表型鉴定：第一是将两个独立突变位点的个体杂交，分析其后代的基因型和表型；第二是将突变体与野生型杂交后回交，观测突变性状与基因型的共分离情况；第三是通过对目的基因的遗传转化，看能否使突变体的表型得以恢复，从而将表型与目的基因联系起来。

鉴定异源多倍体植物基因功能时，最主要是需要克服因多倍体带来的基因多拷贝。拟南芥基因组中单拷贝基因（多数都是）[3]，其对应的DNA编码区域在芥菜型和白菜型油菜基因组中有3个左右的拷贝[4-5]，在甘蓝型油菜基因组的功能基因一般维持4个左右的拷贝[6]。这样，单一基因的突变可能对表型的变化影响不易检测出来，这时，可筛选其不同拷贝基因的突变体，通过二突或者多突的方式鉴定基因功能。

另外，在基因功能分析时还需要注意其等位基因对该基因功能的影响。如在研究大麦棱型时，发现这一性状主要由Vrs位点的HvHox1基因控制，但对获得的同一位点突变的HvHox1突变体分析发现，等位基因int-c的差异影响着表型变化[7]，即突变体表型变化还与目标基因的等位基因有关。

成功鉴定突变基因功能尚需要QTL、转录组、代谢组以及生理学等技术手段获得相应目的基因信息，尤其对于多倍体植物突变体鉴定。如Slade研究小组[8]通过单体分析和QTL等数据信息发现控制四倍体小麦糯性即直链淀粉合成的Waxy基因有两个拷贝，进而通过TILLING在近1920份M2代突变体库材料中筛选到一系列从野生的到无效的246个Waxy等位基因，从中选出这两个拷贝功能都缺失的突变单株，该单株达到了理想的直链淀粉和支链淀粉比例。在研究芸苔属芥酸合成代谢中，多个研究小组通过定位芸苔属中与芥酸相关的QTL，发现脂肪酸延长基因（FAE1）与芥酸合成之间的高度关联性，汪念[9]进一步筛选甘蓝型油菜基因BAC文库，获得了芥酸合成过程中两个拷贝的FAE1基因，进而改进引物设计思路，筛选出了多个FAE1突变体，其中部分突变体芥酸含量较低。

6 展 望

迄今为止，TILLING技术已经成功应用在水稻、玉米、小麦、大麦、百脉根、大豆、花生等植物突变体筛选中，对基因功能的挖掘起到了至关重要的作用。针对烟草相对较高的突变频率，如何消除多突变点背景、基因冗余、多拷贝等影响，是一个值得深入研究的问题。

[1]Wang T,Uauy C,Till B,et al.TILLING and associated technologies[J].J Integr Plant Biol,2010,52:1027-1030.

[2]Chawade A,Sikora P,Brautigamet M,et al.Development and characterization of an oat TILLING-population and identification of mutations in lignin and beta-glucan biosynthesis genes[J].BMC Plant Biol,2010,10:86.

[3]Bouchez D,Hofte H.Functional genomics in plants[J].Plant Physiol,1998,118:725-732.

[4]Haberer G,Mader M T,Kosarev P,et al.Large-scale cis-element detection by analysis of correlated expression and sequence conservation between Arabidopsis and Brassica oleracea[J].Plant Physiol,2006,142:1589-1602.

[5]Town C D,Cheung F,Maiti R,et al.Comparative genomics of Brassica oleracea and Arabidopsis thaliana reveal gene loss,fragmentation,and dispersal after polyploidy[J].Plant Cell,2006,18:1348-1359.

[6]Udall J A,Wendel J F.Poluploidy and crop improvement[J].Crop Sci,2006,46:3-13.

[7]Gottwald S,Bauer P,Komatsuda T,et al.TILLING in the two-rowed barley cultivar 'Barke' reveals preferred sites of functional diversity in the gene HvHox1[J].BMC Res Notes,2009,2:258.

[8]Slade A J,Fuerstenberg S I,Loeffler D,et al.A reverse genetic,nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING[J].Nat Biotechnol,2005,23:75-81.

[9]汪念.甘蓝型油菜EMS突变体库的构建及TILLING、EcoTILLING技术的应用研究[D].武汉：华中农业大学，2009.