烤烟根系分泌物的分离鉴定及对种子萌发的影响

高欣欣，于会泳，张继光，刘帅帅，时 鹏，王树键，申国明*

（1.中国农业科学院烟草研究所，中国农业科学院青岛烟草资源与环境野外科学观测试验站，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

鉴于对我国农田种植制度、土地流转方式及经济效益等方面的考虑，烟草连作种植制度依然普遍，烟草连作对烟叶产量和品质以及烟草生长发育都具有严重的不良影响[1]，已成为制约我国烟草农业发展的主要障碍[2-3]。为了减轻烟草连作障碍，国内外学者从土壤理化性质、生物学性质、土壤病虫害等多方面进行了大量研究[4-7]。有研究表明，烟草根系分泌物对烟草幼苗生长、根系养分吸收以及根系活力等都有抑制作用[8]，并能够减少土壤中微生物种类和数量，破坏烟草生长的微生态环境[9]，但有关烟草根系分泌物具体化学成分的研究较少。本研究通过对烤烟根系分泌物中化学成分进行分析，为烟草根系分泌物的深入研究提供理论基础，这对消除烟草连作障碍具有重要理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为山东烟区烤烟主栽品种中烟 100、NC89和K326。试验于2010年12月至2011年5月在中国农业科学院青岛烟草资源与环境野外科学观测试验站进行。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗砂培 用10%的盐酸浸泡石英砂后，用水冲洗至无氯离子且pH稳定为止，采用托盘育苗法进行常规育苗，幼苗大十字期时选择生长一致的幼苗进行移栽。每天浇营养液200 mL；参试营养液组成如下：Ca(NO3)21.90 g/L；NH4H2PO40.24 g/L；Mg(SO4)·H2O 0.98 g/L；K2SO41.029 g/L；CaCl2，0.894 g/L；KNO31.22 g/L；H3BO31.90 g/L；MnCl2·4H2O 1.8 g/L；ZnSO4·H2O 0.22 g/L；CuSO4·5H2O 0.08 g/L；H2MoO4·4H2O 0.09 g/L；EDTA-Fe。

1.2.2 烤烟根系分泌物的收集提取 移栽后培养40 d，完整取出生长一致的烟株，分别放入一定量去离子水中培养（每24 h更换收集一次去离子水），连续收集 2 d。收集液过滤后用乙酸乙酯萃取。方法为：取定量过滤后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为中性组分；将剩余水相用1M HCl调节pH至2后，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为酸性组分；将剩余水相再用1M NaOH调节pH为8，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为碱性组分，将酸性、碱性和中性乙酸乙酯萃取液分别减压浓缩至1 mL（45 ℃），过0.45 μm滤膜[10]。

1.2.3 根系分泌物的硅烷化处理 将乙酸乙酯萃取后的上述浓缩样品中分别加入0.25 mL硅烷化试剂（BSTFA:TMC=5:1），加盖密封后于 80 ℃水浴中衍生2 h，待测[11]。

1.2.4 GC-MS分析条件 硅烷化后的各组分根系分泌物采用Agilent7890A-5975C测定。采用电子轰击源，轰击电压70eV，扫描范围M/Z 30-600AMU，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度230 ℃。毛细管柱：HP-5MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，柱温50 ℃（2 min），以6 ℃/min程序升温至250 ℃（保持15 min）。载气为He，流量1 mL/min，进样量为1 μL。应用NiST08质谱数据库，分析质谱图，确定各组分物质名称。

1.2.5 种子发芽率和发芽势测定 实验 1：取中烟100根系分泌物进行3个组分萃取，方法同1.2.2，萃取后浓缩10倍，制成3个组分根系分泌物的乙酸乙酯浓缩液。准确吸取各组分乙酸乙酯浓缩液10 mL，加入铺有3层滤纸的培养皿中，待乙酸乙酯挥发后，加蒸馏水5 mL，对照先加10 mL乙酸乙酯，待挥发后加入5 mL蒸馏水。实验2：将延胡索酸、丁二酸、烟碱3种物质用去离子水溶解为不同浓度的溶液（延胡索酸：50、150、750、1000 mg/L；丁二酸：500、750、1000、2000 mg/L；烟碱：100、500、750、1000 mg/L），准确吸取5 mL以上各浓度溶液加入铺有3层滤纸的培养皿中。每个培养皿中整齐排入100粒烟草种子，每个处理3个重复，在28 ℃、4000 Lux下的光照培养箱中培养，调查并计算种子的发芽势（7 d）和发芽率（14 d）。

2 结 果

2.1 根系分泌物种类和含量差异

在不同提取条件下，3个品种共有的根系分泌物主要是有机酸类、甘油和烟碱（表1）。通过品种间两两比较分析可知，其共有成分大部分是有机酸类，例如苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸等。这说明不同品种烤烟根系分泌物中的主要成分是大分子有机酸。此外，3个品种的根系分泌物具有各自的特点，其中在中性提取条件下，中烟 100含量较高的根系分泌物有肉豆蔻酸（66.25%）、延胡索酸（11.45%）；K326含量较高的有丁二酸（27.90%）、2-羟基丙酸（15.87%）和软脂酸（14.52%）；NC89含量较高的有东莨菪素（27.28%）、软脂酸（16.08%）。在酸性提取条件下，中烟 100含量较高的根系分泌物有丁二酸（49.53%）、延胡索酸（12.29%）；K326含量较高的有软脂酸（57.09%）；NC89含量较高的有2-羟基丙酸（24.34%）、丁二酸（16.41%）、软脂酸（10.36%）。在碱性提取条件下，中烟100含量较高的根系分泌物有软脂酸（20.85%），其次为硬脂酸（18.02%）；品种K326含量较高的有硬脂酸（23.85%），其次为软脂酸（20.51%）；NC89含量较高的为棕榈酰胺（30.24%）。

表1 各品种根系分泌物含量Table1 Root exudates contents of each variety

2.2 不同提取条件下根系分泌物对烟草种子发芽势和发芽率的影响

2.2.1 发芽势 由表2可以看出，与空白对照相比，根系分泌物的3种组分对烟草种子发芽势均有不同程度的抑制作用，中性组分的抑制作用最强，与对照呈极显著差异；酸性组分与对照呈显著差异。但3个组分之间差异不显著。不同组分对烟草种子发芽势的抑制作用顺序依次为：中性组分＞酸性组分＞碱性组分。

表2 中烟100各组分根系分泌物对烟草种子发芽势的影响Table2 Effects of different components of exudates from Zhongyan100 on seminal germination viability

2.2.2 发芽率 从图1可以看出，添加不同组分根系分泌物时的种子发芽率均低于空白对照，其中空白对照的发芽率为86%，添加中性组分后发芽率为47%，添加碱性组分为65%，酸性组分为50%。表明根系分泌物的3种组分对烟草种子发芽率均有抑制作用。不同组分对烟草种子发芽率的抑制作用大小顺序依次为：中性组分＞酸性组分＞碱性组分。可以从侧面反映出酸中性条件下所提取的根系分丁二酸随浓度增加对发芽势的抑制作用呈现先增加后降低然后再增加的趋势；延胡索酸在浓度达到300 mg/L时烟草种子发芽势为65%，与空白对照相比降低了18%；丁二酸在浓度达到1000 mg/L时烟草种子发芽势为65%，与对照相比降低了18%；烟碱含量为750 mg/L时烟草种子发芽势为60%，与对照相比降低了24%。泌物中含有对烟草生长起主要抑制作用的物质。

图1 中烟100不同组分根系分泌物对烟草种子发芽率的影响Fig.1 Effects of different components of exudates from ZhongYan100 on seminal germination percentage

2.3 根系分泌物主要成分对烟草种子发芽率和发芽势的影响

2.3.1 发芽率 选取根系分泌物延胡索酸、丁二酸和烟碱进行烟草种子发芽率试验（图2），可以看出，添加3种物质后，种子发芽率均低于对照（浓度为0的处理），表明此3种物质对发芽率均有抑制作用，并且随着其浓度的增加，发芽率逐渐降低，且降低趋势逐渐变大；未添加外源物质（浓度 0）处理的种子发芽率为82%，延胡索酸浓度300 mg/L时，发芽率为降为71%；丁二酸在浓度为1000 mg/L时发芽率降为77%；烟碱含量为750 mg/L时，烟草种子的发芽率为64%；均对烟草种子的发芽率有抑制作用。

2.3.2 发芽势 由图3可以看出，添加3种物质后烟草种子发芽势均降低。随着延胡索酸和烟碱浓度的增加发芽率逐渐降低，降低趋势逐渐变大；其中

3 讨 论

通过对3种烤烟根系分泌物的种类和含量进行分析，得出烤烟根系分泌物主要包括2-甲基丙酸、丁二酸、延胡索酸、苯甲酸、月桂酸等有机酸，以及烟碱，新植二烯等烟草特有物质和少量的酮类、醇类。这与吴天祥等[12]研究结果基本一致。并且通过对不同提取条件下根系分泌物对种子发芽率的影响，表明其抑制作用表现为中性组分＞酸性组分＞碱性组分，分析得到烤烟根系分泌物中的主要化学成分为丁二酸、苯甲酸、延胡索酸、软脂酸和硬脂酸等，这与陈绍莉等[13]、侯永侠等[14]在茄子、辣椒根系分泌物中的研究结果一致，这主要与烟草和辣椒、茄子同属为茄科作物有关。

本试验选取3种烟草根系分泌物研究对烟草种子发芽率和发芽势的影响，结果表明，他们均对发芽势和发芽率有影响，且随着浓度的增加影响越明显。对丁二酸的试验结果与马二培[15]的研究结果一致。另有研究表明，根系分泌物对大豆种子萌发及作物生长也具有一定的抑制作用[16-17]。

图2 不同浓度延胡索酸、丁二酸、烟碱对烟草种子发芽率的影响Fig.2 Effects of different concentration of fumaric acid, succinic acid and nicotine on seminal germination percentage

图3 不同浓度延胡索酸、丁二酸、烟碱对烟草种子发芽势的影响Fig.3 Effects of different concentration of fumaric acid, succinic acid and nicotine on seminal germination viability

本试验主要对生育前期（移栽后40 d）根系分泌物进行了调查，与中后期的分泌状况存在差异，所使用的砂培培养，定期收集分泌物的方法在定性研究上具有先进性，但与大田生长环境也存在差异。为了进一步探索根系分泌物在土壤中的消长规律，揭示烟草连作障碍机理，减轻连作障碍，有必要对烟草根系分泌物与烟草的生长发育的关系进行更深入的研究。

[1]晋艳，杨宇虹，段玉琪，等.烤烟轮作、连作对烟叶产量质量的影响[J].西南农业学报，2004，17（S1）：267-271.

[2]张继光，申国明，张久权，等.烟草连作障碍研究进展[J].中国烟草科学，2011，32（3）：95-99.

[3]时鹏，张继光，王正旭，等.烟草连作障碍的症状机理及防治措施[J].安徽农业科学，2011，39（1）：120-122.

[4]邓阳春，黄建国.长期连作对烤烟产量和土壤养分的影响[J].植物营养与肥料学报，2010（4）：840-845.

[5]邵孝侯，刘旭，周永波，等.生物有机肥改良连作土壤及烤烟生长发育的效应[J].中国土壤与肥料，2011（2）：65-67.

[6]张翼，张长华，王振民，等.连作对烤烟生长和烟地土壤酶活性的影响[J].中国农学通报，2007（12）：211-215.

[7]张永春，黄镇，关国经，等.不同农业生态调控措施对烟草青枯病的影响[J].中国烟草科学，2007，25（4）：49-52.

[8]郭亚利，李明海，吴洪田，等.烤烟根系分泌物对烤烟幼苗生长和养分吸收的影响[J].植物营养与肥料学报，2007，13（3）：458-463.

[9]周宝利，孙传齐，韩琳，等.邻苯二甲酸二丁酯对茄子根际土壤黄萎菌数量及土壤微生物组成的影响[J].华北农学报，2010（6）：150-153.

[10]Tang C S, Young C C.Collection and Identification of Alielopathic Compounds from the Undisturbed Root System of Bigalta Limpograss[J].Plant Physiol,1982(69): 155-160.

[11]Chang L W, Yu Z L, Wang W T.Gas chromatography-mass spectroscopy on metabolic product of organic acid in urine[J].Chromatogram, 1990,8(1): 127.

[12]吴文祥.烟草自毒物质及其对根际土壤微生物影响的研究[D].福州：福建农林大学，2010.

[13]陈绍莉，周宝利，王茹华，等.嫁接对茄子根系分泌物中肉桂酸和香草醛的调节效应[J].应用生态学报，2008，19（11）：2394-2399.

[14]侯永侠，周宝利，吴晓玲，等.辣椒根系分泌物化感作用的研究[J].沈阳农业大学学报，2007，38（4）：505-507.

[15]马二培.丁二酸浸种对玉米生长发育及产量的影响[D].郑州：河南农业大学，2007.

[16]韩丽梅，王树起，鞠会艳，等.大豆根分泌物的鉴定及其化感作用的初步研究[J].大豆科学，2000，19（2）：119-125.

[17]胡元森，李翠香，杜国营，等.黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应[J].生态环境，2007，16（3）：954-957.