柱前衍生高效液相色谱法测定新疆金鸡菊中游离氨基酸

马晓丽，赵东升，孙自增，李新霞，毛新民

(1.新疆医科大学分析测试中心，新疆乌鲁木齐830000;2.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐830000)

金鸡菊Coreopsis basalis又名昆仑雪菊，属菊科金鸡菊属Coreopsis的干燥头状花序［1］。目前在新疆和田地区种植较为广泛，是维吾尔族世代传承下来的一种养生、保健的天然植物。新疆维吾尔医院也将其作为一种维药材应用，民间将其当茶饮用，有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效。药理实验也证明新疆金鸡菊对冠心病、高血脂、糖尿病均有特殊的疗效［2-4］。

据文献报道，金鸡菊中主要含有黄酮、挥发油、多糖和氨基酸等活性成分，目前还没有金鸡菊质量控制的药材标准，文献［5］采用氨基酸自动分析仪分析了新疆金鸡菊中总氨基酸的含有量，但该方法所用试剂量大、测试成本较高，且分析得出的是蛋白水解后的氨基酸含有量，缺乏准确性。近年来高效液相色谱法成为检测氨基酸的重要方法［6-8］，本实验采用柱前衍生高效液相色谱法分析新疆金鸡菊中主要游离氨基酸的含有量，尝试通过对其中多种游离氨基酸进行检测来评价新疆金鸡菊药材的质量，为新疆金鸡菊中氨基酸成分的研究提供参考。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Waters e2695，UV-2489紫外检测器，色谱柱(Shim-pack VP-ODS，4.6 mm×25 cm，5 μm)，Empower 3色谱工作站;分析天平(Sartorius，BS110S，d=0.1 mg);氮吹仪(天津恒奥科技，HSC-12A);快速混匀器(金坛市医药仪器厂，SK-1)。

氨基酸对照品天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Aspa)丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)色氨酸(Trp)、赖氨酸(Lys)(生化试剂，纯度均大于98%)乙酸钠(天津市光复精细化工厂，优级纯);正己烷、三乙胺(TEA)(天津市富宇化工有限公司，分析纯);异硫氰酸苯酯(PITC)(上海金山亭新化工公司);乙腈和甲醇为色谱纯;milli-Q超低有机物超纯水机制备超纯水(美国Millipore公司生产)。

金鸡菊样品采自新疆和田地区，由新疆雪菊生物科技公司提供，经新疆医科大学药学院胡君萍博士鉴定。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液配制分别精密称取18种氨基酸对照品适量，置于同一25 mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶解并定容至刻度，作为氨基酸贮备溶液。

2.1.2 供试品溶液配制精密称定和田地区金鸡菊样品粉末(40目)约2.0 g。加水40 mL，浸泡1 h，100 kHz 60℃超声提取30 min，过滤，滤渣同上方法再次提取，过滤，合并滤液，低压旋转浓缩后定容至50 mL，得质量浓度为0.04 g/L的供试品溶液。

2.2 衍生化反应

2.2.1 衍生化试剂配制

1 mol/L三乙胺乙腈溶液∶取三乙胺1.3 mL，加乙腈定容至10 mL量瓶中，混匀备用。

0.1 mol/LPITC乙腈溶液:取PITC 0.3 mL，加乙腈定容至25 mL量瓶中，混匀备用。

2.2.2 对照品和供试品衍生化取对照品溶液和供试品溶液200 μL，加入0.1 mol/L PITC乙腈溶液100 μL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，涡旋混匀，室温放置20 min，加入正己烷500 μL，充分震摇混匀后，10 000 r/min离心5 min，分层后，吸取下层溶液(正己烷萃取2次)，用0.45 μm滤膜滤过，备用。以水作为阴性对照溶液，同法进行衍生。

2.3 色谱条件色谱柱:Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6mm×25 cm，5 μm，岛津);流动相A:称取15.2 g无水乙酸钠，加水1 850 m L，溶解后用冰醋酸调pH值6.5，然后加乙腈140 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤。流动相B:甲醇-乙腈-水=(20∶60∶20)，梯度洗脱见表1;体积流量:1.0 mL/min;检测波长:254 nm柱温:35℃;进样量:10 μL。

表1 梯度洗脱程序

取衍生化后的对照品、样品及阴性对照溶液进样测定。根据保留时间可见新疆金鸡菊中主要氨基酸。各氨基酸的理论塔板数均不低于5 000。

3 结果与讨论

3.1 专属性考察在上述色谱条件下进样分析，标准溶液、样品色谱图见图1(A、B、C)。由图可见18种氨基酸在35 min内基本达到了完全分离，内源性物质和衍生化试剂不干扰氨基酸的测定。

图1 HPLC色谱图

3.2 线性考察分别精密量取氨基酸混合对照品溶液0.20、0.5、1、2、3、4、5 mL各置10 mL量瓶中，用水定容至刻度，得到7种不同质量浓度的氨基酸对照品混合溶液。按照2.2项下衍生后测定，记录色谱图。以进样质量浓度C为横坐标，进样峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。结果见表2。

表2 18种氨基酸的线性方程

3.3 方法的精密度、重复性及稳定性试验取对照品溶液200 μL，按照2.2.2项方法衍生后连续进样5次，以及分别在0、2、4、8、12、24 h进样，以色谱峰峰面积为指标计算RSD，考察其精密度和稳定性，18种氨基酸标准溶液的精密度试验RSD在0.26%～3.43%(n=5);衍生产物稳定性试验RSD在2.28%～3.58%(n=5)。取同一批金鸡菊干燥粉末5份，按2.1.2项方法提取、2.2.2项下衍生、测定，以色谱峰峰面积为指标分别计算RSD，考察方法的重复性，各氨基酸峰面积的RSD在2.85%～3.97%。

3.4 回收率试验精密称取已知含有量的同一批次金鸡菊样品6份，准确加入一定量的氨基酸混和标准溶液，按照2.2.2项方法衍生、进样，外标法定量，平行5次，计算各氨基酸的回收率和RSD。样品测定结果表明，由于样品中只有12种氨基酸被准确检出并定量，因此本实验只计算了12种氨基酸的平均回收率，在94.08%～105.3%之间;RSD在0.96%～2.97%。结果见表3。

3.5 样品测定取衍生好的样品溶液200 μL，按照上述的色谱条件进行测定，外标法定量，样品测定结果表明，新疆金鸡菊中的游离氨基酸主要以脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸为主，占游离氨基酸总量的79.2%，其次是胱氨酸、丝氨酸、缬氨酸等，样品中谷氨酸、组氨酸、络氨酸、蛋氨酸未达到检出限，而苯丙氨酸在线性以下，未能定量。结果见表4。

表3 样品中各个氨基酸的加标回收率(n=5)

表4 不同地区氨基酸质量分数(n=3)

4 讨论

氨基酸柱前衍生主要采用的衍生化试剂有异硫氰酸苯酯(PITC)和邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)、丹酰氯等，根据本组的预实验发现OPA衍生法虽然快速，但衍生产物极不稳定，很容易降解，而丹酰氯法需要水浴反应，较麻烦。因此本实验采用异硫氰酸苯酯进行氨基酸的衍生，反应生成苯氨基硫甲酰衍生物(phenylthiocarbamylaminoacide，PTC-AA)，本方法灵敏度高，衍生化产物稳定、单一，衍生试剂杂质峰不干扰测定，结果18种氨基酸对照品在35 min内能够完全分离，适用于新疆金鸡菊中游离氨基酸的快速测定。

本实验考察了不同流动相梯度比例，不同反应时间及不同萃取次数对衍生产物的影响，结果根据色谱柱情况调整了梯度比例后，可以有效的分离各氨基酸，本实验同时考察了不同衍生时间对测定的影响，发现室温衍生20 min、30 min及1 h对衍生产物峰面积影响不大，因此选用室温反应20 min对氨基酸进行测定，还考察了多次溶剂萃取对衍生产物的影响，由于衍生试剂对色谱柱有一定的损害，当用正己烷进行多次萃取后发现萃取次数对氨基酸的峰面积影响不大，但可以有效减少衍生试剂的残留，同时可以减少其对色谱柱的损害，延长色谱柱的使用寿命，因此最后本实验选用样品与衍生试剂室温反应20 min，正己烷萃取2次后进样分析测定。

本实验对新疆不同地区的金鸡菊中游离氨基酸含有量进行了测定，结果发现含有量最高的氨基酸为脯氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，三者之和占到总氨基酸量的76.05%～79.41%;不同地区的金鸡菊中氨基酸含有量稍有差异，根据结果新疆和田的皮山地区金鸡菊中游离氨基酸含有量均较高，可能与该地区地理位置，种植品种(系)及生态环境尤其其海拔有一定关系。本方法准确，可靠、经济，能用于新疆金鸡菊药材中氨基酸的测定。

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