大孔吸附树脂法纯化痹痛灵软膏的工艺研究

徐伟，林静瑜，褚克丹，陈立典*，李煌，倪峰，张小琴

(1.福建中医药大学，福建福州350108;2.福建省中医药研究院，福建福州350108;3.福建卫生职业技术学院，福建福州350108)

痹痛灵软膏主要由雷公藤、青风藤、穿山龙、甘草四味药物组成，为福建中医药大学附属人民医院院内制剂痹痛灵酊［1］改剂型而成，临床用于治疗风湿痹阻所致的痹病，症见关节疼痛、腰腿疼痛、屈伸不利等，目前已申请专利(专利申请号:201110347820.4)。但在制备痹痛灵软膏时，由于浸膏率大，且提取物中含有较多糖类以及其他杂质，不利于制剂成型。与其他常规纯化方法相比，大孔吸附树脂纯化方法可明显提高中药制剂中有效成分的相对含有量，同时除去大量的杂质，克服传统中成药“粗、大、黑”的缺点，有利于制剂成型且美观［2］。因此，本实验选择通过大孔吸附树脂纯化痹痛灵提取物，用蒸馏水洗去糖类等杂质，再用一定浓度的乙醇将有效成分洗脱下来，并以雷公藤总二萜内酯的含有量为指标，对大孔吸附树脂的纯化工艺参数进行优选。

1 仪器与试药

1.1 仪器WFZ800—D3B紫外/可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);SHY—2A水浴恒温振荡器(江苏金伟实验仪器厂);XS105电子分析天平(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2 试药雷公藤内酯醇对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111567-200502);雷公藤药材(购自福建省汉堂生物制药股份有限公司);D101、X-5、HPD100、DA-201、AB-8、S-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);3，5-二硝基苯甲酸、氢氧化钾(国药集团化学试剂有限公司);其他试剂为分析纯;水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 样品制备取痹痛灵处方药材适量，用8倍量70%乙醇加热回流2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，加水定容至含复方生药量0.4 g/mL，备用。

2.2 总二萜内酯的比色法测定［3-5］

2.2.1 对照品溶液精密称取雷公藤内酯醇对照品4.5 mg，置25 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液将各洗脱液蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，移至25 mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，制得供试品溶液备用。

2.2.3 阴性对照溶液按处方配制不含雷公藤的样品，同供试品溶液的处理方法制成阴性对照溶液。

2.2.4 Kedde显色剂的配制根据文献报道［1］配制1%3，5-二硝基苯甲酸醇溶液。

2.2.5 测定法根据文献［1］，在546 nm下测定吸光度并计算，得总二萜内酯的含有量。

2.2.6 显色反应稳定性考察根据文献［1］进行测定，选择在显色30 min时测定较为稳定。

2.2.7 线性关系的考察精密吸取雷公藤内酯醇对照品溶液(181.2 μg/mL)，根据文献［1］，配成18.12、27.18、36.24、45.30、54.36、63.42 mg/mL不同质量浓度的溶液。以相应的试剂为参比，以雷公藤内酯醇质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，在546 nm下显色30 min时测定吸光度。得回归方程为Y=0.032 4+0.012 7X，r=0.999 7。表明雷公藤内酯醇的质量浓度在18.12～63.42 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.8 重复性试验从同一样品中精密量取6份，按2.2.5项制备方法制备，测定吸光度，RSD为1.78%，表明重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验精密量取同一批号样品共6份，加入相应的雷公藤内酯醇对照品，按2.2.5项制备方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算得平均回收率为99.96%，RSD为1.67%。结果符合要求。

2.3 大孔吸附树脂纯化工艺研究

2.3.1 大孔吸附树脂的预处理［6-7］大孔吸附树脂先用95%乙醇浸泡24 h充分溶胀，除去上浮的树脂碎片和杂物，湿法装柱，继续用乙醇洗至流出液与水混合(1:5)不呈白色浑浊为止，然后以大量去离子水洗尽乙醇。柱内加入高于树脂层10 cm的4%盐酸溶液浸泡3 h，然后进行淋洗冲柱。继续用3～4倍树脂床体积(BV)同浓度的盐酸溶液冲柱，然后用去离子水洗至接近中性。再用4%的NaOH溶液浸泡3 h。最后淋洗冲柱，用同浓度的3～4倍树脂体积的氢氧化钠溶液冲柱，最后用去离子水清洗至pH值为中性，备用。

2.3.2 树脂型号的筛选精密称取已处理好的各种型号树脂D101、X-5［7］、HPD100［8］、DA-201［9］、AB-8［6］、S-8［10］适量(约相当于干树脂1.0 g)，置100 mL锥形瓶中，分别加入供试液50 mL，放入恒温(28℃)振荡器中振摇24 h，振动频率为120 r/min，充分吸附后，过滤，用50 mL水洗，再用70%乙醇洗脱，弃去水液，收集醇洗脱液，测定总二萜内酯的含有量，计算吸附量。结果见表1。由表中的结果可知，总二萜内酯在D101树脂上的比吸附量、解吸率都明显高于其他树脂，这与树脂的性质和复方中雷公藤的有效成分性质密切相关。结果与文献［11-12］所报道采用D101进行纯化分离时对树脂的选择结果一致。故选择D101作为本复方的树脂型号进行进一步的实验。

表1 不同型号大孔吸附树脂的吸附及解吸能力的比较

2.3.3 上样液质量浓度确定精密量取处理好的D101湿树脂20 mL 5份，湿法装柱，在预试验的基础上准备0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/mL 5种质量浓度的样品液，分别通过D101树脂柱，进行动态吸附，完全吸附后，用100 mL蒸馏水洗脱后，用150 mL 70%乙醇洗脱并收集该组分，测定其中总二萜内酯的含有量，结果见表2。从表2可知，上样液质量浓度以0.4 g/mL为宜。

表2 上样质量浓度的确定

2.3.4 吸附体积流量确定精密量取处理好的D101湿树脂20 mL 3份，湿法装柱，平行准备3份样品液，分别以不同的流速(1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h)通过D101树脂柱，先用100 mL蒸馏水洗脱后，用150 mL 70%乙醇洗脱并收集该组分，测定其中总二萜内酯的含有量。吸附流速为1 BV/h时树脂的吸附效果最好，但上样速度较慢;吸附流速为2 BV/h时与1 BV/h相比，相差较小，但缩短了生产周期。因此，选择上样流速为2 BV/h，即每小时2倍树脂体积量。

2.3.5 泄露曲线考察精密量取处理好的D101湿树脂20 mL，湿法装柱，上样，上样流速为2BV/h，进行动态吸附，分段收集流出液，每10 mL收集一份，测定其中总二萜内酯的含有量，并绘制泄漏曲线。如图1。从图1中可以看到在第11流份时的吸光度明显增大，说明此时总二萜内酯开始明显泄漏，所以确定样品液最大上柱体积为110 mL，从而得出药物的最大上样量为44 g(生药量)。则树脂体积与最佳上样量的比例为1∶2.2。

图1 泄露曲线

2.3.6 样品液pH值的考察精密量取处理好的D101湿树脂20 mL(6份)，湿法装柱，平行取6份样品液，将样品液分别调成pH值为2、4、7、9、10、11(其中pH值为4是样品原液)，上样，上样流速为2 BV/h，吸附完全后，先用100 mL蒸馏水洗脱后，用150 mL 70%乙醇洗脱并收集该组分，测定其中总二萜内酯的含有量。见图2。从图中可知，pH为4的原液中的总二萜内酯含有量最高，故原药液不调pH，直接上样。

图2 样品液pH值的考察

2.3.7 洗脱剂确定精密量取处理好的D101湿树脂20 mL，湿法装柱，精密吸取质量浓度为0.4 g/mL的样品液100 mL，上柱，上样流速为2 BV/h，吸附完全后，依次用蒸馏水100 mL、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各200 mL梯度洗脱。收集各浓度的洗脱液，测定其中总二萜内酯的含有量。见表3。由表3中可知，水洗不能洗下总二萜内酯，10%乙醇即可将总二萜内酯洗脱，50%乙醇洗脱液中累计含有量最大，70%、90%乙醇洗脱液中含有很少量的总二萜内酯，故确定以50%乙醇作为洗脱剂，洗脱有效成分。

表3 洗脱剂浓度的考察

2.3.8 洗脱流速确定将上述所确定的吸附条件进行动态吸附后，树脂柱先分别用水洗脱至洗脱液近无色，再用50%乙醇为洗脱剂，分别以1、2、3 BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定其中总二萜内酯的含有量。洗脱流速为2 BV/h时总二萜内酯的含有量与1 BV/h相差不大，而与3 BV/h相差较大。综合考虑，最中确定洗脱流速为2 BV/h。

2.3.9 洗脱曲线考察将上述所确定的吸附和洗脱条件，取样品液进行上柱、吸附和洗脱，分段收集洗脱液。每个树脂体积(湿体积)收集1份，共收集20份。测定其中总二萜内酯的含有量，据此绘制洗脱曲线，见图3。从洗脱曲线可知，第8份洗脱液中的总二萜内酯基本已洗脱完全，所以确定洗脱剂用量为8倍树脂体积。

图3 洗脱曲线

2.3.10 工艺验证实验精密量取处理好的D101湿树脂20 mL，3份，湿法装柱，精密吸取质量浓度为0.4 g/mL的样品液100 mL，上柱，上样流速为2 BV/h，吸附完全后，依次用100 mL蒸馏水、160 mL 50%乙醇进行洗脱，收集50%乙醇洗脱组分，测定其中总二萜内酯的含有量。另精密吸取一定量置干燥至恒质量的蒸发皿中，测定浸膏的质量。结果见表4。说明痹痛灵软膏纯化工艺合理、稳定、可行。

表4 大孔吸附树脂精制前后测定结果

3 结论与讨论

3.1 大孔吸附树脂纯化痹痛灵软膏最佳工艺为树脂类型D101，上样液质量浓度含生药0.4 g/mL，吸附流速为2 BV/h，树脂体积与最大吸附量比为1∶2.2，原药液不调pH，洗脱剂为50%乙醇，洗脱流速为2 BV/h，乙醇用量为8B倍树脂体积。

3.2 痹痛灵软膏中含有雷公藤(君药)，其有效成分雷公藤总二萜内酯为本纯化工艺的考察指标。因内酯环在碱性条件水解开环，故在pH值考察中发现，随着pH值的升高，所测得的总二萜内酯含有量明显降低，在实验过程中发现，pH值调高，大孔吸附树脂洗脱后的颜色较深，说明水解后的总二萜内酯并不能很好的被洗脱下来，故本实验中采用原液上样即可。

3.3 中药复方提取液中常含有大量的糖类、无机盐、黏液质等，得到的干膏量较大，不利于制剂成型，采用大孔吸附树脂纯化提取液后，干膏率显著降低，易于制剂成型且美观，克服了未纯化前制剂出现的有粗颗粒、不均匀细腻的缺点。

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