正交优化超声波法提取瓦松总黄酮工艺的研究

祝波，王亚红

(吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022)

瓦松Orostachys fimbriatus为景天科瓦松属植物，又名流苏瓦松，全国各地均有分布，以全草入药。始载于《唐本草》，据《中国药典》2010年版一部记载其味酸、性平、无毒，归肝、肺、脾经。具有清热解毒、止血、利湿、消肿等功效，用于吐血、鼻衄、血痢、疟疾、痔疮、湿疹、痈毒、疔疮等症［1］。现代药理研究表明该植物具有抗癌、抗炎、抗菌、强心、抗病毒和免疫调节等作用［2］。国内外学者对瓦松属药用植物的化学成分及生物活性进行了一系列研究，并取得一定进展［3-4］，瓦松主要含黄酮(flavonoids)、木栓酮(friedelin)、没食子酸(gallic acid)、齐墩果酸(oleanolic acid)、胡萝卜苷(carrot glycoside)、尿嘧啶(uracil)等化学成分，因此用途广泛，具有药、食两用价值，同时也是饲料、化妆品原料与园艺花卉［5］。笔者为研究瓦松总黄酮现代化提取工艺，充分开发利用瓦松资源，特以主要成分总黄酮为考察指标，采用正交实验设计方法优选其最佳提取工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 材料瓦松(购自吉林市江城大药房，经鉴定为瓦松Orostachys fimbriatus)，粉碎过40目筛备用。芦丁标准品(购自中国药品生物制品检定所;批号:100080-200707)。

1.2 试剂无水乙醇，甲醇，无水三氯化铝，醋酸钠，冰醋酸，以上试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备超声波药品处理机JBT/CYCL400T/3P(D)(济宁金百特电子有限责任公司)，紫外可见分光光度计752N(上海精密仪器有限公司)，电子天平BS-600L(上海精细科技仪器厂)，移液管(北京玻璃仪器厂)，旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)，多功能粉碎机RT-08(荣聪精密科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备精密称取110℃干燥至恒质量的芦丁标准品10.5 mg，置于50 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声溶解，冷却后定容，配制成质量浓度为0.21 mg/mL的芦丁标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备称取40目的瓦松药材粉末5 g，置于锥形瓶中，加入60%乙醇40 mL，超声提取(功率400 W，温度40℃，频率40.1 kHz，时间40 min)，过滤，滤液移入50 mL量瓶中，用60%乙醇定容，吸取1.0 mL转移到一干燥5 mL量瓶中，用60%乙醇定溶得到供试品溶液。在提取工艺研究中，改变相应参数。

2.3 检测波长的确定取芦丁标准品溶液1.0 mL、供试品溶液1.0 mL于2个10 mL量瓶中，加入A1C13溶液(0.1 mol/L)1.0 mL，醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=5.5)1.0 mL，并用60%乙醇溶液定容，摇匀，静置20 min。用试剂作空白对照，在300～500 nm波长范围内进行紫外测定，结果芦丁供试品溶液和标准品溶液在416 nm处均出现最大吸收，因此，确定测定波长为416 nm。

2.4 标准曲线的绘制精密移取芦丁标准品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于6个10 mL量瓶中，加入A1C13溶液(0.1 mol/L)1.0 m L，醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=5.5)1.0 mL，并用60%乙醇溶液定容，摇匀，静置20 min。用试剂作空白对照，测定416 nm波长处的吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归［6］，得回归方程:y=85.00 2x+0.398 9，r=0.999 6。表明芦丁在21～126μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 瓦松提取液中总黄酮的测定取瓦松提取液1.0 mL于5 mL量瓶中，用相应试剂作空白对照，测定各样品溶液在416 nm波长处的吸光度，若测定结果超出线性范围，可先浓缩或稀释再进行测定。把吸光度代入回归方程求质量浓度，然后计算提取液中总黄酮的含有量以及总黄酮提取率，计算公式如下:

总黄酮质量(mg)=(C×V1×V2)/(V3×1 000)

总黄酮提取率(%)=(总黄酮质量/药材中总黄酮的质量)×100%

C表示所测定瓦松提取液总黄酮的质量浓度(μg/mL);V1为制备供试品溶液时定容的体积(mL);V2为所得提取液的总体积(mL);V3为从提取液中移取的用于制备供试品溶液的体积(mL)。

2.6 方法学研究

2.6.1 精密度实验对同一供试品溶液重复取样，按2.4项、2.5项下方法测定、计算5次，RSD为0.78%，表明用该方法测定精密度良好。

2.6.2 稳定性实验精密吸取供试品溶液1.0 mL，按2.4项下方法分别在0、20、40、60、120、180、240 min时测定吸光度，按2.5项下方法计算提取率。RSD为0.38%，显示在4 h内样品溶液稳定。

2.6.3 重复性实验准确移取同一份供试品溶液，按2.4项、2.5项下方法平行测定6次、计算提取率，RSD为0.97%，表明该测定方法重复性良好。

2.6.4 加样回收率实验称取已知含有量的样品6份(质量分数8.91%)，精密加入芦丁标准品10mg，按2.4项、2.5项下方法测定、计算，平均回收率为98.04%，RSD为0.67%。

2.7 单因素实验

2.7.1 提取时间的影响准确称取5份40目的瓦松药材5 g，置于锥形瓶中，按2.2项下方法分别在20、25、30、35、40 min超声提取，测定吸光度，计算提取率。结果表明随着提取时间的延长，总黄酮提取率逐渐提高，提取时间超过30 min，提取率不再增大或减小。

2.7.2 固液比的影响准确称取5份40目的瓦松药材5 g，置于锥形瓶中，设置提取时间30 min，分别按固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%的乙醇溶液，研究固液比对总黄酮提取率的影响。结果表明随着固液比的增加，总黄酮提取率逐渐增大，固液比大于1∶20时，提取率增加不再明显，基本保持原状。

2.7.3 超声频率的影响准确称取5份40目的瓦松药材5 g，置于锥形瓶中，按固液比1∶20加入60%的乙醇溶液，设定提取时间30 min，分别在超声频率23.7、40.1、47.6、66.6、71.6 kHz进行超声提取，考察超声频率对总黄酮提取率的影响。结果表明随着超声频率的增加，总黄酮提取率先逐渐增大，后减小，频率为47.6 kHz时，提取率最高。

2.7.4 提取温度的影响分别称取6份40目的瓦松药材5 g，置于锥形瓶中，按固液比1∶20加入60%的乙醇溶液，设定超声频率47.6 kHz，分别在40、45、50、55、60、65℃超声提取30 min，测定吸光度，计算提取率。结果表明总黄酮提取率先逐渐增大，后减小，50℃时提取率达到峰值。

2.8 超声提取工艺正交实验根据单因素实验结果，对提取时间、固液比、超声频率、提取温度4个因素进行L9(34)正交实验，因素水平见表1，正交设计及结果见表2。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验结果

由表2直观分析可知各因素对实验结果影响的顺序为:提取温度＞固液比＞提取时间＞超声频率，最佳工艺条件为A3B2C2D1，即提取时间40 min，固液比1∶20，超声频率47.6 kHz，提取温度40℃。

2.9 最佳工艺条件的验证性实验按最佳工艺条件提取3份各5 g瓦松粉末，测定吸光度，计算平均提取率。平均提取率为0.802%，RSD为1.65%，结果显示优化得到的工艺条件科学合理、具有可行性。

2.10 超声提取与常规提取法的对比研究超声提取按2.9项的最佳提取工艺条件进行。准确称取3份40目的瓦松药材5 g，采用传统热水回流法提取瓦松总黄酮，提取时间4 h，提取温度40℃，提取固液比1∶20，测定吸光度，计算平均提取率。平均提取率为0.356%，RSD为1.05%。结果见表3。

表3 两种提取方法的比较

从表3实验结果可知，超声提取与常规热水回流提取的最大差别表现在提取时间和提取率这两方面。超声提取法的总黄酮提取率比传统提取法提高0.446%，所需时间大大缩短。

4 结论

将超声技术应用于瓦松总黄酮的提取，能够增加黄酮类物质的提取率。文中探讨了与超声波作用效应相关的提取时间、固液比、超声频率、提取温度4个因素对黄酮提取率的影响，同时采用正交实验优化最佳工艺条件。最佳工艺条件为提取时间40 min，固液比1∶20，超声频率47.6 kHz，提取温度40℃。在这个最佳条件下黄酮提取率为0.802%。与传统水提方法比较，超声提取具有省时、节能、易于操作、提取率高等优点，是一种较好的瓦松总黄酮提取新工艺。

［1］郑万金，仲英，孙敬勇，等.瓦松的化学成分研究［J］.中草药，2009，40(6):859-862.

［2］安琨，郑万金，李海波，等.瓦松化学成分的研究(Ⅱ)［J］.食品与药品，2011，13(7):247-249.

［3］Kim H J，Lee J Y，Kim S M，et al.A new epicatechin gallate and calpain inhibitory activity from Orostachys japonicus［J］.Fitoterapia，2009，80(1):73-76.

［4］Je Ma C，Jung W J，Lee K Y，et al.Calpain inhibitory flavonoids isolated from Orostachys Japonicus［J］.J Enzyme Inhib Med Chem，2009，24(3):676-679.

［5］郑万金，张萍，仲英.瓦松属植物的研究进展［J］.齐鲁药事，2008，27(3):161-163.

［6］汪明礼.回归分析在分析化学中的应用［J］.黄山学院学报，2005(3):40-41.