柴胡疏肝散水提液HPLC特征图谱研究及指标成分的测定

王术玲，贾薇，高晓玲

(广州中医药大学中药学院，广东广州510006)

柴胡疏肝散出自《景岳全书·古方八阵》，由陈皮、柴胡、枳壳、香附、川芎、白芍、甘草七味药组成，是疏肝理气的代表方剂，主治胁肋疼痛、寒热往来。现代多用于治疗抑郁症［1-4］、高脂血症［5］、肝脾不和引起的消化系统疾病［6-7］以及一些妇科病［8］等。柴胡疏肝散复方中成分复杂，其化学成分有黄酮、皂苷、生物碱、挥发油及有机酸等。复方中药的药效是由其所包含的成分群的种类及各成分的量共同决定的，特征图谱能比较全面地反映复方的化学成分体系。因此，本实验试图建立柴胡疏肝散的特征图谱，同时对方中各药味的指标成分，如白芍的芍药苷、甘草的甘草苷、陈皮和枳壳的柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷，进行定量分析［9］。

1 仪器与试药

日本岛津LC—20AT高效液相色谱系统，配有SPD—M20A检测器，SIL—20A自动进样装置，DGU—20A5在线脱气，CTO—10AS VP柱温箱;电子分析天平(BP—211D型，德国赛多利斯公司);分析天平(LIBROR AEG—220型，日本岛津公司)。

芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品均购自中国药品生物制品检定所，甘草酸铵、阿魏酸购自四川省维克奇生物科技有限公司;柴胡、白芍、陈皮、枳壳、川芎、香附、甘草均购于广州至信药业有限公司，经检验符合《中国药典》2010年版规定。乙腈为色谱纯，超纯水自制，其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 色谱条件［10］Thermo Syncronis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为(A)0.2%磷酸-(B)乙腈，按表1进行梯度洗脱，数据采集时间65 min;体积流量1 mL/min;检测波长为230 nm(芍药苷)，277 nm(甘草苷)，283 nm(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷);柱温25℃;进样量10 μL。在此条件下，对照品及样品各峰分离度均良好(如图1)。

表1 流动相梯度Tab.1 G radient of mobile phase

图1 柴胡疏肝散水提液高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of Chaihu Shugan Decoction

2.2 对照品溶液的制备精密称取于五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h以上的芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇分别制成0.719 6 mg/mL、0.093 76 mg/mL、2.103 mg/mL、1.440 mg/mL、1.203 mg/mL的对照品贮备液。分别精密吸取上述对照品贮备液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 柴胡疏肝散水提液的制备准确称取陈皮3.000 g、柴胡3.000 g、川芎2.500 g、香附2.500 g、枳壳2.500 g、芍药2.500 g、甘草1.500g置回流瓶中，加水200 mL，浸泡30 min，置水浴中加热回流1 h，滤过，滤液至250 mL量瓶中，用水洗涤药渣及瓶壁，洗液滤过并入量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 供试品溶液的制备精密量取柴胡疏肝散水提液20 mL至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇24 mL转移至25 mL量瓶中，超声处理30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 线性关系考察取混合对照品溶液，分别进样3、5、10、15、20、30 μL进行测定。以峰面积积分值Y对进样量X(μg)进行回归分析，得回归方程:芍药苷Y=1 188 694X+2 361，r2=0.999 9;甘草苷Y=1 808 442X+1 719，r2=0.999 9;柚皮苷Y=1 572 505X+46 320，r2=0.999 9;橙皮苷Y=1 739 805X+14 764，r2=1.000 0;新橙皮苷Y=1 867 211X+34 757，r2=0.999 9。表明芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷分别在0.215 9～2.159 μg、0.028 13～0.281 3 μg、0.630 9～6.309 μg、0.432 0～4.320 μg、0.361 0～3.610 μg范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验取同一份柴胡疏肝散供试品溶液连续进样6次，以柚皮苷为参照物，17个共有峰的相对保留时间RSD均低于1.0%，以5个指标成分的峰面积计算RSD为芍药苷1.2%、甘草苷1.3%、柚皮苷1.1%、橙皮苷1.7%、新橙皮苷1.0%，其余共有峰的相对峰面积RSD均小于2.0%，说明精密度良好。

2.7 重复性试验取同一份柴胡疏肝散水提液平行制备6份供试品溶液，分别进样测定，以柚皮苷为参照物，各共有峰的相对保留时间变化均在2.0%之内，计算5个指标成分的质量浓度及RSD分别为芍药苷0.084 19 mg/mL(RSD=1.8%)、甘草苷0.028 16 mg/mL(RSD=1.7%)、柚皮苷0.184 2 mg/mL(RSD=1.6%)、橙皮苷0.134 2 mg/mL(RSD=1.8%)、新橙皮苷0.151 4 mg/mL(RSD=1.6%)，其余主要色谱峰的相对峰面积RSD均小于5.0%，说明重复性良好。

2.8 稳定性试验取同一份柴胡疏肝散供试品溶液，密闭置于室温条件下放置，分别于制备后0、3、6、9、12 h进样测定，以柚皮苷为参照物，17个共有峰的相对保留时间的RSD值均低于1.0%，以峰面积计算RSD，结果为芍药苷1.9%，甘草苷1.9%，柚皮苷1.4%，橙皮苷1.9%，新橙皮苷1.6%，其余共有峰的相对峰面积RSD均小于3.5%，表明样品在12h内稳定。

2.9 加样回收率试验精密量取同一份柴胡疏肝散水提液10 mL至蒸发皿中，共6份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按2.4项制备，平均回收率结果为芍药苷96.5%(RSD 2.2%)，甘草苷102.8%(RSD 1.0%)，柚皮苷98.0%(RSD 1.3%)，橙皮苷98.8%(RSD 1.5%)，新橙皮苷99.6%(RSD 1.6%)，见表2。

表2 加样回收率实验(n=6)Tab.2 Results of recovery(n=6)

2.10 样品测定按2.3项制备10份柴胡疏肝散水提液，依法制备供试品溶液并测定，各精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，记录0～65 min色谱图。分别计算5种指标成分，结果为芍药苷(0.10±0.02)mg/mL、甘草苷(0.030±0.006)mg/mL、柚皮苷(0.24±0.04)mg/mL、橙皮苷(0.14±0.03)mg/mL、新橙皮苷(0.22±0.05)mg/mL。

根据10份柴胡疏肝散水提液的色谱图，在230nm检测波长下共标定17个共有特征峰(如图2-a)，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对测定结果进行评价，17个共有峰的峰面积占总峰面积95%以上，所测样品的相似度均大于0.95，符合要求。

2.11 色谱峰归属按2.3项下方法平行制备单味药材水煎液及相应的阴性样品，并按2.4项同法制备供试品溶液，进样测定。与对照品及全方的色谱图对比分析，研究17个共有峰的归属，见图2。除5号和7号峰外，其余15个色谱峰都找到对应归属药味(见表3)，提示5号和7号峰有可能是煎煮过程中生成的新成分。

图2 柴胡疏肝散、单味药对照及阴性对照的色谱图(230 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of Chaihu Shugan Decoction，single Chinese medicine and negative samples under the wavelength of 230 nm

3 讨论

3.1 本实验中所测5个指标成分的最大吸收波长不一致，为了增加检测灵敏度，每个成分均采用各自的最大吸收波长做为检测波长，即芍药苷230 nm，甘草苷277 nm，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷283 nm。通过多个波长下全谱图的比较，认为230 nm下出峰最多、峰形较好、分离度符合要求，所以特征图谱研究以230 nm做为检测波长。

3.2 在一般的特征图谱研究中，由于参比峰与其它峰均存在各自的质量分数变化，双变量下的相对峰面积控制法的误差较大，不可控性因素多。本实验所建立的方法将特征图谱和几个主要指标成分的定量测定融合在一起，最终形成的色谱图化学信息完整，色谱峰分离度好，特征明显，可以比较全面地控制该制剂的质量［11-12］。

［1］林冰，夏进.加味柴胡疏肝散治疗抑郁症临床研究［J］.新中医，2011，43(8):36-37.

［2］刘娟，仲诚.柴胡疏肝散化裁治疗中风后抑郁40例［J］.中国中医急症，2012，21(5):788.

［3］牛德斌.柴胡疏肝散对抑郁症小鼠模型行为学改变影响的实验研究［J］.中医学报，2012，27(6):706-707.

［4］刘兰英，冯斌，王佩蓉，等.柴胡疏肝散合并文拉法辛对抑郁症患者血清T淋巴细胞亚群及NK细胞的影响［J］.中国现代应用药学，2012，29(5):393-397.

［5］常建国.柴胡疏肝散加味治疗肝郁气滞血瘀型高脂血症［J］，四川中医，2010，28(4):72-73.

［6］田玉霞.柴胡疏肝散在中医内科的临床运用［J］.中医临床研究，2012，4(8):94.

［7］吴慧，徐有水，刘日才.柴胡疏肝散在消化系统疾病中应用举隅［J］.浙江中西医结合杂志，2012，22(4):273-275.

［8］程贤英，张慧艳，黄君，等.柴胡疏肝散在妇科病中的应用［J］.云南中医中药杂志，2012，33(2):35-36.

［9］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:80，96，176，229.

［10］王春艳，张丹参，张万明，等.HPLC-DAD测定柴胡疏肝散中4种活性成分的含量［J］.中成药，2010，32(3):422-4250.

［11］李婧，刘汉清，孙小芬.丹参注射液多成分定量测定和指纹图谱研究［J］.中成药，2011，33(4):553-556.

［12］张俐，王玉.鼻炎康片指纹图谱研究［J］.中成药，2011，33(11):1844-1850.