HPLC 法同时测定补肺益肾颗粒中淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷

李娟，赵迪，周悌强，冯素香，李建生

(河南中医学院，河南郑州450008)

补肺益肾颗粒处方是在原补肺益肾处方基础上精简而成［1-2］，由淫羊藿、陈皮、赤芍、黄芪、五味子、山茱萸等十二味中药组成，现为河南中医学院第一附属医院制剂。该方具有补肺益肾、化痰、活血的功效，是中医治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期肺肾气虚证的有效药物，可减轻炎症反应和黏液分泌，减少对气道壁的损伤，减轻气道阻塞，从而降低对肺组织的损伤，延缓肺功能的下降［3-6］。其中淫羊藿为方中君药，陈皮、赤芍为方中臣药，原质控标准仅对该颗粒剂中淫羊藿苷进行测定，不能全面反映产品质量信息。为有效控制产品质量，本实验采用HPLC法同时对该颗粒剂中有效成分淫羊藿苷、橙皮苷和芍药苷进行定量分析，为建立简便易行的质量控制方法提供依据。

1 仪器、试药

1.1 仪器Waters高效液相色谱仪(2695高效液相泵，2996二极管阵列检测器，Empower 2工作站;美国waters公司);SHZ—D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);KH—2200DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);Sarterius BS 224S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);EYELA N—1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);HH—6型数控恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)。

1.2 试药芍药苷(批号0736-200414)、淫羊藿苷(批号0737-9709)、橙皮苷(批号0773-9809)均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈(HPLC级，Grace Company INC)，甲醇(分析纯，天津四友精细化学品有限公司)，磷酸(分析纯，天津鸥博凯化工有限公司)，娃哈哈纯净水;补肺益肾颗粒(河南中医学院第一附属医院药剂科提供)。

赤芍、淫羊藿、陈皮等药材均购自河南郑州张仲景大药房，经河南中医学院陈随清教授鉴定分别为毛茛科植物川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornumMaxim.的干燥地上部分、芸香科植物橘Citrus reticulateBlanco的干燥成熟果皮等。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)(博纳艾杰尔科技有限公司)，柱温:25℃;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱(A%为19→19→28→28，相应时间周期为0→6→7→20min);体积流量:1.0 mL/min;检测波长:270 nm。

2.2 对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含淫羊藿苷0.112mg、橙皮苷0.359 mg、芍药苷0.258 mg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取本品约2 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备按处方量并以相同的工艺分别制备不含淫羊藿、陈皮、赤芍的阴性对照样品，照上述供试品溶液制备方法处理，得阴性对照溶液。

2.5 专属性实验精密吸取对照品、供试品及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定。结果阴性对照色谱中，在与对照品及供试品色谱图对应保留时间处无相应色谱峰，表明其它组份对测定淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷3个成分无干扰，见图1。

图1 对照品(A)、供试品(B)、缺赤芍阴性样品(C)、缺陈皮阴性样品(D)和缺淫羊藿阴性样品(E)高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of m ixed reference substancea(A)，sample(B)，negative sample without Paeoniae Radix rubra(C)，negative sample without Citri reticulatae Pericarpium(D)，negative sample without Epimedii Folium(E)

2.6 线性关系考察分别精密量取2.2项下的对照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液。精密吸取2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，峰面积和进样量分别取对数得Y和X，并以Y对X进行回归分析，得到淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的回归方程，见表1。

表1 线性关系考察结果Tab.1 Results of linear correlation

结果表明:淫羊藿苷在0.022 4～0.280 μg，橙皮苷在0.071 8～0.898 μg，芍药苷在0.051 6～0.645 μg范围内有良好的线性关系。

2.7 精密度实验照上述HPLC色谱条件，对同一对照品溶液连续进样6次，以峰面积为指标考察仪器的精密度，结果表明，淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷对照品峰面积的RSD分别为1.2%、1.4%、1.1%。

2.8 稳定性实验取同一供试品溶液于0、2、4、6、8、12 h分别进样20 μL进行HPLC测定，淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷峰面积的RSD分别为0.9%、1.2%、0.8%，表明样品供试液在12 h内稳定性良好。

2.9 重复性实验取同一批样品6份，制备供试品溶液，按上述HPLC色谱条件进行测定，记录峰面积并计算，结果淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的平均质量分数分别为0.087 6 mg/g、0.367 mg/g、0.243 mg/g，RSD分别为2.17%、2.43%、2.29%，表明重复性良好。

2.10 耐用性实验

2.10.1 不同色谱柱精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，选取不同的色谱柱(艾杰尔，V9510525CL0028;依利特，E1517560;Waters，WAT045905)进行分离，其它色谱条件不变，进行测定，结果淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的平均质量分数分别为0.088 0 mg/g、0.363 mg/g、0.247 mg/g，RSD分别为2.56%、2.31%、2.19%。

2.10.2 不同柱温精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，柱温分别设定为20℃、25℃、30℃，其它色谱条件不变，进行测定，结果淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的平均质量分数分别为0.087 2 mg/g、0.371 mg/g、0.239 mg/g，RSD分别为2.15%、2.48%、2.34%。

2.10.3 不同波长精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，波长分别设定为265 nm、270 nm、275 nm，其它色谱条件不变，进行测定，结果淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的平均质量分数分别为0.087 4 mg/g、0.366 mg/g、0.242 mg/g，RSD分别为1.98%、2.23%、2.68%。

以上结果表明不同色谱柱、不同柱温、波长的微小变化对样品色谱峰的分离度和含量测定结果均未有明显影响。

2.11 加样回收率实验取已知含有量(淫羊藿苷0.087 8 mg/g，橙皮苷0.369 mg/g，芍药苷0.245 mg/g)的补肺益肾颗粒约1 g，共9份，精密称定，分为3组，每组分别加入质量浓度为0.112 mg/mL的淫羊藿苷、0.359 mg/mL的橙皮苷、0.258 mg/mL的芍药苷对照品0.8、1.0、1.2 mL，照上述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，结果显示淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的加样回收率的RSD分别为2.65%、2.12%、2.36%，见表2～4。

表2 淫羊藿苷加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery tests of icariin

表3 橙皮苷加样回收率实验结果Tab.3 Results of recovery tests of hesperidin

表4 芍药苷加样回收率实验结果Tab.4 Results of recovery tests of paeoniflorin

2.12 样品的测定取3批补肺益肾颗粒(20110218、20110425、20110603)，照2.3项下供试品溶液制备方法制备，2.1项下HPLC色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算，测定结果见表5。

表5 3批次样品测定结果(n=3)Tab.5 Determ ination results of three batches of sam ples(n=3)

3 讨论

3.1 提取方法的选择补肺益肾颗粒为中药复方制剂，所含成分复杂多样。颗粒剂含有量测定时供试品溶液制备方法主要有超声、回流［7-9］。该实验对这两种提取方法进行了比较，超声提取淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的平均质量分数分别为0.056 9 mg/g、0.668 mg/g、0.364 mg/g，RSD分别为2.18%、1.27%、1.58%;回流提取淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷的平均质量分数分别为0.057 0 mg/g、0.669 mg/g、0.368 mg/g，RSD分别为1.93%、2.16%、2.41%。结果表明，采用超声和回流方法提取含有量相近，无显著性差异。超声提取操作简便，因此本实验选择超声处理作为供试品溶液的制备方法。

3.2 检测波长的选择该实验同时测定3个成分，但芍药苷、淫羊藿苷、橙皮苷的最大吸收波长分别为230 nm、270 nm、320 nm［10-13］，因此本实验对检测波长进行了筛选，分别在200～400 nm范围内不同波长下测定混合对照品，实验结果表明在270 nm可以同时兼顾这3个成分，且呈良好线性关系，故检测波长选择在270 nm。

3.3 洗脱梯度的选择补肺益肾颗粒中含有多种化学成分，很难找到较为理想的等度洗脱条件。本实验分别考察了以乙腈-纯水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水［14-16］作为流动相时不同浓度和比例的等度以及梯度洗脱的出峰情况，确定了以乙腈-0.1%磷酸水为流动相时分离度较好。通过反复改变乙腈所占比例和变化的时间，最终确定了该实验的梯度洗脱程序，在此条件下，供试品溶液中淫羊藿苷、橙皮苷和芍药苷与相邻成分分离良好，且阴性溶液无干扰。

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