蝉蜕不同提取工艺抗凝与纤溶活性比较研究

曹唯仪，黄镇林，何亮颖，赵韶华，王玉蓉

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102;2.河北以岭医药集团有限公司，河北 石家庄 050035)

蝉蜕(Cryptotympana pustulate Fabricius)为蝉科昆虫黑蚱羽化时脱落的皮壳，性寒、味咸，辛凉解表，长于疏风清热、明目退翳、透疹止痒、利咽、解痉。临床多用于治疗风热感冒、咽痛音哑、麻疹不透、风疹瘙痒、目赤翳障、惊风抽搐及破伤风等，为中国药典2010年版(一)部收载［1］。现代药理学研究表明，蝉蜕除具有解热、镇痛、镇静、抗惊厥、解痉等作用外，还具有一定的抗凝作用，如蝉蜕水提液可显著降低高脂血症大鼠红

基金项目:北京中医药大学复方中药制药研究创新团队资助项目(2011-CXTD-13)

作者简介:曹唯仪(1989-)，女，北京中医药大学2011级中药制药学专业硕士研究生，主要研究方向:中药复方新型释药系统研究。

通讯作者:王玉蓉(1951-)，女，教授，博士研究生导师，主要研究方向:中药复方新型释药系统研究。

收稿日期:2012-07-12

修回日期:2012-08-10

细胞聚集指数

［2］

，抵抗体外血栓形成，并能明显缓解哮喘的“微观血瘀”状态

［3］

。临床研究发现，蝉蜕与水蛭、䗪虫、全蝎等配伍同用，能明显抑制血栓形成和血小板聚集，延长凝血时间，对络脉瘀阻的心血管系统疾病有很好的治疗作用

［4］

，但其有效物质基础的研究报道尚少。为此，本研究拟通过凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血小板聚集率和血凝-纤溶动态图试验，比较并综合评价蝉蜕仿生胃/胰蛋白酶解物、水提物、醇提物、水提醇沉物抗凝纤溶活性，为蝉蜕工艺筛选和抗凝物质基础的研究奠定基础。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器 800B型离心机(上海安亭科学仪器厂);ES-120型电子分析天平(长沙湘平科技发展有限公司);恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂);DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);LGPABER-Ⅰ型血小板聚集仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司)。

1.2 试药 蝉蜕(由石家庄以岭医药集团有限公司提供);胃蛋白酶1:10 000(Sigma P7000，北京环亚泰克生物医学技术有限公司);胰蛋白酶1:250(Amresco0458，北京华美转导科技有限公司);PT试剂盒(上海太阳生物试剂公司);APTT试剂盒(上海太阳生物试剂公司);乙醇(分析纯);ADP(Sigma，北京环亚泰克生物医学技术有限公司);乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，分析纯);枸橼酸钠(西陇化工股份有限公司，分析纯)。

1.3 动物 家兔20只，购自北京海淀兴隆实验动物养殖场，体质量约2kg，雌雄各半，动物许可证号:SCXK(京)2011-0006。

2 方法

2.1 蝉蜕不同提取物的制备

2.1.1 仿生酶解［5］称取蝉蜕药材细粉8g于250mL圆底烧瓶，按固液比1∶20加入人工胃液(取盐酸9mL，加蒸馏水稀释成1 000mL，即得)，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入3.0%胃蛋白酶水解3h，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min灭酶，冷却至室温，以4 500r/min离心15min，取上清液水浴挥干，即得蝉蜕胃蛋白酶酶解物。残渣称重按固液比1∶20加入人工肠液(取 0.2mol/L磷酸二氢钾溶液 250mL，加0.2mol/L溶液118mL，用水稀释至1 000mL，摇匀，即得)，密闭，于45℃恒温水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，将酶解液于85℃恒温水浴作用15min灭酶，冷却至室温，以4 500r/min离心15min，取上清液，干燥即得蝉蜕胰蛋白酶酶解物。

2.1.2 水提取 称取蝉蜕药材细粉8g于250mL圆底烧瓶，按固液比1∶20加蒸馏水，回流提取3次，每次2h，合并提取液，干燥，即得蝉蜕水提物。

2.1.3 乙醇提取 称取蝉蜕药材细粉8g于250mL圆底烧瓶，分别按固液比1∶20加乙醇70%、90%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，回收干燥，即得蝉蜕70%、90%醇提物。

2.1.4 水提醇沉 称取蝉蜕药材细粉8g于250mL圆底烧瓶，按固液比1∶20加蒸馏水，回流提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩至药液比1∶1，加入95%乙醇至含醇量70%，置冰箱中放置过夜后4 500r/min离心15min，取上清液回收干燥，即得蝉蜕70%水提醇沉物。同法操作，加入95%乙醇至含醇量90%，置冰箱中放置过夜后4 500r/min离心15min，取上清液回收干燥，即得蝉蜕90%水提醇沉物。残渣干燥，即得醇沉渣。

2.2 抗凝纤溶药效试验

2.2.1 供试品溶液的制备 取上述适量蝉蜕提取物，加生理盐水或90%乙醇配制成浓度为10mg/mL溶液，即为供试品溶液。

2.2.2 血浆制备 取健康家兔(雌雄各半，产地北京)耳缘静脉注射乌拉坦麻醉，颈动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以1 000r/min离心10min，取上清液，即得富血小板血浆(PRP)，以3 000r/min离心10min，取上清液，即得贫血小板血浆(PPP)。

2.2.3 PT试验［6］取 PPP100μL于测试杯中，加样品液10μL，37℃预温3min，加入 PT 试剂 200μL(预温3min)，开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准确记录凝固时间。以生理盐水或90%乙醇为阴性对照(每个样品平行测定6份)。

2.2.4 APTT试验［6］取 PPP100μL于测试杯中，加样品液10μL，37℃预温3min，加入 APTT试剂100μL(预温 5min)，孵育 5min后加入 CaCl2100μL(预温15min)，开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准确记录凝固时间。以生理盐水或90%乙醇为阴性对照(每个样品平行测定6份)。

2.2.5 血小板聚集率试验［7］PPP调零后，将PRP 300μL与样品液10μL置于测试杯中37℃预温10min，加入诱导剂ADP(1mmol/L)10μL，测定10min内血小板最大聚集率。以生理盐水或90%乙醇为阴性对照(每个样品平行测定6份)。

血小板最大聚集率=PRP最大聚集时与基线之间的距离/90×100%

血小板聚集抑制率=(对照管血小板聚集率%-给药管聚集率%)/对照管血小板聚集率% ×100%

2.2.6 血凝-纤溶动态图试验［7］取PRP 150μL与样品液10μL混匀，37℃预温10min，PPP调零，同时加入0.1mol/L CaCl250μL，搅动10s，平衡记录仪记录动态图，直至图形峰值持续稳定2min为止，以生理盐水或90%乙醇为阴性对照(每个样品平行测定6份)。所得曲线即为血凝-纤溶动态图。根据动态图观察以下参数:

1)凝固启动时间(CST):即从曲线开始前，与横轴平行的直线线段。CST反映从凝固剂加入到纤维蛋白开始形成所需要的时闻，是体现血凝开始快慢的参数。2)最大凝固程度(MCE):即曲线上升的峰值段，也是开始凝固到凝固完全时透光度变化的峰值。MCE的高低与测定用血浆量，即纤维蛋白原水平有关。它表示液态的纤维蛋白原已基本凝固成凝胶态的纤维蛋白，凝固反应已基本完成。3)凝固时间(CT):即从曲线开始到曲线峰值所需的时间，CT是血浆开始凝固到凝固完全所需的时间，是反映血浆凝固快慢的参数。4)平均凝固速度(ACR):即MCE/CT的比值，代表平均每秒钟形成的凝固程度，ACR是反映纤维蛋白形成，即血凝反应速度的参数。

图1 纤溶图示意图CST:a-b;MCE:c-d;CT:b-c;ACR=MCE/CT

2.3 计算与统计 使用统计软件SPSS 17.0对数据进行正态性检验，方差分析和双侧t检验，P＜0.05表示具有显著性差异。

3 结果与讨论

3.1 PT与APTT药效考察 结果见表1。

表1 蝉蜕不同工艺提取物PT、APTT药效考察(±s，n=5)

表1 蝉蜕不同工艺提取物PT、APTT药效考察(±s，n=5)

注:与空白组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名称 PT(s) APTT(s)生理盐水对照组 胃蛋白酶解物6.99±0.14 15.61±1.44胰蛋白酶解物 6.99±0.18 31.00±1.19*水提物 7.45±0.20 32.70±1.10＊＊90%水提醇沉(渣)6.95±0.15 32.04±1.01＊＊生理盐水(空白) 7.24±0.11 29.98±0.65 90%乙醇对照组 70%乙醇提取物 6.68±0.19 44.05±1.59 90%乙醇提取物 5.93±0.24 47.80±0.94 70%水提醇沉物 7.29±0.17 48.24±1.38 90%水提醇沉物 6.85±0.12 49.48±1.56 90%乙醇(空白)7.93±0.13 49.95±1.27

PT结果表明，所有蝉蜕提取物均不能明显延长PT值，推测其抗凝作用可能与外源性凝血系统无关。

APTT结果表明，与生理盐水对照，胰蛋白酶解物、水提物、90%水提醇沉(渣)可延长APTT，推测其可干扰内源性凝血因子的活性，达到抗凝作用。

3.2 血小板聚集率药效考察 结果见表2。

表2 蝉蜕不同工艺提取物血小板聚集率药效考察(±s，n=5)

表2 蝉蜕不同工艺提取物血小板聚集率药效考察(±s，n=5)

注:与空白组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名称 血小板聚集率(%)血小板抑制率(%)生理盐水对照组 胃蛋白酶解物83.27±4.59 0.09胰蛋白酶解物 71.68±4.87＊＊ 0.22水提物 84.22±11.44 0.08 90%水提醇沉(渣)76.52±5.62* 0.16生理盐水(空白) 91.33±11.78 0.00 90%乙醇对照组 70%乙醇提取物 17.63±3.17 -0.20 90%乙醇提取物 9.65±2.32＊＊ 0.34 70%水提醇沉物 14.72±2.85 0.00 90%水提醇沉物 24.10±3.43 -0.64 90%乙醇(空白)14.72±1.35 0.00

结果表明:与生理盐水为对照，蝉蜕胰蛋白酶解物、90%水提醇沉(渣)具有显著抑制血小板聚集的作用;与90%乙醇为对照，以90%醇提物抑制血小板聚集的作用最为明显。

3.3 血凝-纤溶动态图药效考察 结果见表3。

表3 蝉蜕不同工艺提取物血凝-纤溶动态图药效考察(±s，n=5)

表3 蝉蜕不同工艺提取物血凝-纤溶动态图药效考察(±s，n=5)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名称 CST(s) CT(s) MCE(%) ACR(%/s)生理盐水对照组 胃蛋白酶解物 306.50±15.60＊＊ 34.00±11.31*25.92±6.98 0.76胰蛋白酶解物 259.33±8.89 27.83±9.35 25.65±7.78 0.92水提物 212.50±6.38 24.00±3.03 43.88±10.66 1.83 90%水提醇沉(渣) 166.00±6.63 22.83±4.07 15.85±5.67* 0.69生理盐水(空白) 259.33±7.23 22.00±2.90 35.07±15.43 1.59 90%乙醇对照组 70%乙醇提取物 256.33±10.63 4.83±2.48 5.08±3.52 1.05 90%乙醇提取物 253.50±7.40 4.67±2.94 5.35±4.39 1.15 70%水提醇沉物 254.50±5.47 4.17±1.17 5.10±4.09 1.22 90%水提醇沉物 269.33±6.09＊＊ 4.33±2.94 5.78±4.80 1.33 90%乙醇(空白)243.50±11.90 4.67±2.07 5.15±3.60 1.10

结果表明，与生理盐水对照，蝉蜕胃蛋白酶解物、胰蛋白酶酶解物、90%水提醇沉(渣)不同程度的延长CT，降低MCE和ACR，而对CST的影响只有胃蛋白酶解物能够显著延长，胰蛋白酶酶解物延长并不显著，说明蝉蜕胃蛋白酶解物、胰蛋白酶酶解物、90%水提醇沉(渣)提取方法主要是通过抑制纤维蛋白原转化成纤维蛋白，减慢血浆凝固，达到抗凝效果。90%乙醇对照组中，只有90%水提醇沉物表现出延长CST作用，对CT、MCE、ACR 效果不显著。

3.4 结论分析 结果如表4。

表4 蝉蜕不同提取方法抗凝指标综合结果

结论:APTT实验结果表明，胰蛋白酶解物、水提物和90%水提醇沉(渣)具有明显的抗凝效果;血小板聚集率实验表明，胰蛋白酶解物、90%醇提物和90%水提醇沉(渣)具有明显的抗血小板聚集效果;血凝-纤溶动态图药效以平均凝固速度(ACR)值表明，胃/胰蛋白酶解物和90%水提醇沉(渣)效果最为明显。

4 讨论

本研究以PT、APTT、血小板聚集率、血凝-纤溶动态图四项抗凝纤溶药效为指标，考察了蝉蜕仿生酶解法、水提法、醇提法、水提醇沉法不同提取方法，得到8种提取物的抗凝纤溶效果。

由于提取物溶解度的不同，分别选用生理盐水或90%乙醇作为对照组。结果显示，生理盐水溶解的各组对各项指标均优于90%乙醇组，推测原因可能是乙醇本身对血浆中凝血因子、血小板、蛋白质等物质有影响而造成的结果偏差。

结果表明，蝉蜕八种提取物对PT指标均无明显作用，推测提取物均不是通过外源性凝血途径抗凝，提示系通过内源性凝血途径达到抗凝;APTT、血小板聚集率、血凝-纤溶三项指标显示，仿生胃/酶蛋白酶解物和水提醇沉(渣)均表现出显著的抗凝作用，因此在抗凝纤溶作用方面，选取仿生酶解提取法或水提醇沉法作为继续研究对象更具有实验价值。

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