加味消渴康对糖尿病肾病大鼠纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ型胶原表达的影响

张 铖 李凤婷 李 梦 岳顺卿 耿建国* 章九红

(1.首都医科大学中医药学院中医临床基础教研室，北京100069;2.河南省平顶山市医学会，平顶山467000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管病变之一，是以肾小球硬化症为主要病理变化的严重合并症，也是引起终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要原因之一［1］。研究［2］显示，纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型胶原等细胞外基质在肾组织内积聚可以导致肾小球硬化，进而引起DN发生。因此，减少细胞外基质的积聚是延缓DN发生的关键环节。本实验采用免疫组织化学方法，观察加味消渴康对糖尿病肾病大鼠肾组织FN、LN及Ⅳ型胶原表达的影响，现将实验结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

SD雄性大鼠24只，体质量160～180 g，鼠龄2～3月龄，购自首都医科大学实验动物部〔动物的合格证号：SCXX(京)2006-0009〕。加味消渴康由生黄芪10 g、山萸肉30 g、生薏仁30 g、水蛭6 g、葛根30 g、丹参10 g、决明子10 g组成，药材购自北京祥威药业公司;氯沙坦购自杭州默沙东制药有限公司(生产批号：09422)。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司);兔抗FN多克隆抗体(美国abcam公司);兔抗LN多克隆抗体(美国abcam公司);兔抗Ⅳ型胶原多克隆抗体(美国abcam公司)。

1.2 动物模型及分组

1)糖尿病肾病动物模型的建立：将造模大鼠适应性饲养1周后，行右侧肾脏切除术。术后2周，禁食12 h，按50 mg/kg体质量的剂量进行单次腹腔内注射。72 h后，尾静脉采血，用sure-step血糖仪测定大鼠血糖，用尿糖试纸测大鼠随意尿糖，血糖浓度≥16.7 mmol/L，尿糖定性＞+++，确定DN造模成功。

2)分组及给药：将成模大鼠用数字表法随机分为4组，每组6只。正常组(A组)、模型组(B组)、氯沙坦组(C组，给药量为成人药量/60 kg×6.25，即5.2 mg/kg)、中药组(D组，给药量为成人药量/60 kg× 6.25，13.125 g·kg－1·d－1)每日1次，连续灌胃12周，正常组及模型组每日灌服等量蒸馏水。

1.3 标本采集和检测方法

各组大鼠于给药后第12周末进行肾脏取材。肾组织常规制片，运用免疫组织化学法测定肾组织FN、LN和Ⅳ型胶原的蛋白表达，400倍镜下随机选择10个视野，并用图文处理系统进行分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0 for Windows进行统计处理，计量数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析法和LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 治疗后各组大鼠血糖、肾功能比较

血糖方面，模型组及给药组较正常组明显升高，差异有统计学意义(F=17.476，P＜0.01);在肾功能方面，模型组及给药组血尿素氮较正常组明显升高，差异有统计学意义(F=21.767，P＜0.01);模型组、氯沙坦组血肌酐较正常组升高，差异有统计学意义(F =1.676，P＜0.05)，详见表1。

表1 各组大鼠血糖、肾功能比较Tab.1 Comparison of blood glucose and renal function among four groups of rats

2.2 对肾组织FN表达的影响

1)肾组织免疫组织化学检测结果：正常组肾小管间质FN表达最少(图1A);模型组肾小管间质FN表达最多(图1B);氯沙坦组FN表达少于模型组(图1C);中药组FN表达少于西药组(图1D)。

2)积分吸光度比较结果：与正常组比较，模型组、氯沙坦组、中药组差异有统计学意义(F=29.947，P＜0.01);与模型组比较，氯沙坦组差异有统计学意义(F=29.947，P＜0.05)，中药组差异有统计学意义(F =29.947，P＜0.01);中药组与西药组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，详见表2。

2.3 对肾组织LN表达的影响

1)肾组织免疫组织化学检测结果：正常组肾小管间质LN表达最少(图2A);模型组肾小管间质LN表达最多(图2B);氯沙坦组LN表达少于模型组(图 2C);中药组LN表达少于西药组(图2D)。

2)积分吸光度比较结果：与正常组比较，模型组、中药组差异均有统计学意义(F=17.691，P＜0.01);与模型组比较，西药组、中药组差异均有统计学意义(F=17.691，P＜0.01)，详见表3。

表2 各组大鼠肾小管间质纤维粘连蛋白积分吸光度比较Tab.2 Comparison of tubulointerstitial fibronectin sumdensity among four groups

表3 各组大鼠肾小管间质层粘连蛋白积分吸光度比较Tab.3 Comparison of tubulointerstitial laminin sumdensity among four groups

2.4 对肾组织Ⅳ型胶原表达的影响

1)肾组织免疫组织化学染色结果：正常组肾小管间质Ⅳ型胶原表达最少(图3A);模型组肾小管间质Ⅳ型胶原表达最多(图3B);氯沙坦组Ⅳ型胶原表达少于模型组(图3C);中药组Ⅳ型胶原表达少于西药组(图3D)。

图3 各组大鼠肾小管间质Ⅳ型胶原的表达Fig.3 Tubulointerstitial collagenⅣexpression of each group(400×)A：normal group;B：model group;C：losartan group;D：traditional Chinese medicine group.

2)积分吸光度比较结果：与正常组比较，模型组、西药组差异均有统计学意义(F=5.322，P＜0.05，P＜ 0.01);与模型组比较，中药组差异有统计学意义(F =5.322，P＜0.05);中药组与西药组比较差异无统计学意义，详见表4。

表4 各组大鼠肾小管间质Ⅳ型胶原积分吸光度比较Tab.4 Comparison of tubulointerstitial collagenⅣsumdensity among four groups

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病的血管合并症，多隐匿起病，早期不易察觉，而到晚期出现显性蛋白尿时，则已经错过治疗时机。因此诊断和治疗DN宜早不宜晚，应该在肾脏病变处在代偿期时予以干预，延缓其进展到失代偿期。其中，中医药治疗则是有效方法之一［3］。

根据糖尿病肾病本虚标实的病机，以扶正祛邪为治疗法则，应用加味消渴康治疗糖尿病肾病，在临床上取得了一定疗效。本方由生黄芪、山萸肉、生薏米、葛根、决明子、丹参、水蛭组成，具有健脾益肾，祛瘀化浊的功效。本方在生黄芪、山萸肉等健脾益肾药物的基础上加入了水蛭、丹参等活血化瘀药以及决明子、生薏米等利湿化浊药，旨在糖尿病肾病早期祛除瘀血，清利湿浊，更加有利于顾护正气。研究［4］表明，黄芪可以减轻DN大鼠蛋白尿，改善肾功能，并可抑制肾组织LN的表达。山茱萸环烯醚萜总苷能抑制糖尿病大鼠肾皮质糖化终产物的形成，使其受体mRNA表达水平下降，可以减轻DN病变［5］。决明子可以抑制DN大鼠肾组织内核因子-кB的活性，进而延缓DN的进展［6］。丹参能够保护DN大鼠肾功能，并抑制肾组织转化生长因子-β1和Ⅳ型胶原的表达［7］。仝小林等［8］研究显示，水蛭可以改善DM大鼠血液高粘、高凝状态，并能降低DM大鼠的尿微量白蛋白。顾江平等［9］研究显示，水蛭可以降低DN大鼠肾组织内皮素-1的表达，并能降低肾脏指数(肾质量/体质量)。李琳等［10］研究显示，水蛭可以降低DN大鼠血清肌酐、尿素氮水平，并能降低24 h尿微量白蛋白，此外，水蛭还能降低DN大鼠肾组织转化生长因子-β1及基质金属蛋白酶抑制因子-1的表达，上调基质金属蛋白酶-9的表达。

本实验研究结果显示，加味消渴康能够降低DN大鼠肾组织的FN、LN和Ⅳ型胶原的积聚，对防治糖尿病肾病有一定的作用，其具体作用机制还有待于进一步深入研究。

［1］ 李丹清，宋光华.胶原代谢与糖尿病肾病［J］.国外医学(内分泌学分册)，2002，22(3)：188-191.

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［3］ 丁波.糖尿病肾病的中医临床及实验研究进展［J］.临床误诊误治，2009，22(S2)：18-20.

［4］ 陈胜，李果，龙梅芳.黄芪调节自发糖尿病肾病鼠层粘连蛋白表达的实验研究［J］.现代生物医学进展，2008，8 (7)：1226-1228.

［5］ 许惠琴，朱荃.山茱萸环烯醚萜总苷对实验性糖尿病肾病变的保护作用［J］.南京中医药大学学报，2003，19 (6)：342-344.

［6］ 杨明正，张小如.决明子对糖尿病大鼠肾组织NF-кB活化的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2006，16(3)：149-150.

［7］ 胡波，李锋，王燕午，等.丹参对糖尿病肾病大鼠MMP-2、TIMP-1、TGF-β1和Ⅳ-C表达的影响［J］.时珍国医国药，2008，19(12)：3020-3022.

［8］ 仝小林，周水平，李爱国，等.水蛭对糖尿病大鼠肾脏病变的防治作用及机理探讨［J］.中国中医药信息杂志，2002，9(6)：21-23.

［9］ 顾江平，赵玲，栗德林.水蛭对糖尿病大鼠内皮素-1水平的影响［J］.中成药，2007，29(10)：1421-1424.

［10］李琳，邓小明，王淑玲.水蛭对糖尿病大鼠尿微量白蛋白影响的机制［J］.中国实用医刊，2010，37(13)：62-63.