慢性心力衰竭患者全基因组的甲基化改变

王建龙 李海涛 苏丕雄 顾 松 刘 岩 张希涛 颜 钧 安向光

高 杰2 辛 悦2 蔡 军2*

(1.北京市普仁医院心内科，北京100062;2.首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心，北京100020)

DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一。DNA甲基化与生长、发育等生命活动及肿瘤等疾病的形成息息相关。目前DNA甲基化在肿瘤发生中的作用仍是研究的一个热点，而关于其在心血管疾病发生过程中作用的研究则刚刚起步［1］。本实验用甲基化芯片筛选的方法分析心衰心肌标本和正常心肌标本中DNA甲基化的差异。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1)主要试剂：dNTP-mix购自美国Invitrogen公司; Platinum-DNA-Polymerase购自美国 Invitrogen公司;Invitrogen凝胶回收试剂盒购自美国Invitrogen公司; DNA ladder购自美国 Invitrogen公司;MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit购自美国Invitrogen公司;EZ DNA Methylation-Gold Kit购自美国ZYMO Research公司;质粒小量提取试剂盒购自美国 Axygen公司; pMD18-T购自宝生物(大连)有限公司;Takara Total-Prep RNA扩增试剂盒购自美国Illumia公司。

2)主要仪器：离心机(5810R/5415D)购自美国Eppendorf公司;PCR仪购自美国ABI公司;电泳仪购自美国 Bio-Rad公司;Infinium HumanMethylation27 BeadChip购自美国Illumina公司;HumanHT-12 v4 Expression BeadChip购自美国Illumina公司;实时荧光定量PCR仪(48孔)(TC988型)购自沈阳永鑫益实验仪器销售有限公司;Illumina BeadChip Reader扫描仪(HiScanSQ)购自美国Illumina公司;RNase-Free冻存管购自美国Corning公司;海尔－80℃冰箱 (DW-86L386)购自青岛海尔公司。

3)实验材料：选取2008年至2009年首都医科大学附属北京安贞医院心脏外科收治的心脏移植患者作为研究对象，本实验分正常对照组和疾病组，其中正常组8例取自心脏移植供体左心室心肌，疾病组14例均取自心脏移植患者自身心脏左心房心肌。所有标本采样时液氮中速冻后保存于 －80℃ 冰箱中，并使用液氮运输。该实验通过相关医院伦理委员会批准。

1.2 试验方法

1)DNA甲基化芯片高通量筛选：用美国EZ DNA Methylation Kit将DNA中未甲基化CG岛的C转化为T。基因组DNA经NaOH变性后，加入含引物的MA2 (multi sample amplification 2 Mix)和含酶的MSM(multi sample amplification master Mix)扩增。扩增好的DNA中加入FMS(fragmentation solution)，37℃酶切1 h。加入含盐分溶液PM1和异丙醇，使片段化的DNA沉淀。加入含对照DNA的RA1于48℃放置1 h，使其充分悬浮后加到芯片(Infinium Human Methylation27 Bead Chip)上，48℃杂交16 h～24 h。洗去未杂交的和非特异杂交的DNA并组装杂交舱。以杂交在芯片上的DNA为模板，加入TEM(含SBE酶，biotin-dNTP，DNP)和95%甲酰胺/1 mmol·L－1EDTA，去除目标DNA，芯片上仅留微珠上的单链探针。染色。使用扫描仪通过双色激光激发微珠上的荧光基团，扫描得到杂交信号，采用软件自动分析给出代表甲基化程度的Beta值。

2)mRNA表达谱芯片高通量筛选：取RNA样本加入无RNA酶的水至11 μL，之后与反转录母液9 μL混合42℃孵育2 h合成第一链cDNA，继续添加第二链反应母液80 μL，混合后16℃孵育2 h合成第二链cDNA;继之每个样本中加入250 μL cDNA结合液，cDNA虑柱滤过，用500 μL洗脱液洗涤，用19 μL 50℃ ～55℃无RNA酶液洗脱cDNA完成cDNA纯化;体外转录cDNA后cRNA纯化。RNA扩增所用试剂为Illumia TotalPrep RNA扩增试剂盒。纯化后的cRNA与芯片杂交干燥后采用扫描仪扫描完成图像分析。

3)重亚硫酸盐测序：22个基因组DNA样品各取约500 ng，用MethylCode Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)对基因组DNA进行甲基化处理。用合成好的引物和处理过的基因组DNA进行PCR扩增。凝胶回收PCR产物。将回收的PCR产物与 pMD18-T (Takara)连接，室温连接2 h。取5 μL连接反应液转化100 μL DH5a感受态细胞，涂氨苄平板，37℃过夜孵育。每个平板挑5个克隆接种于3 mL LB中，37℃过夜培养。用质粒小量提取试剂盒(Axygen)提取质粒。对质粒进行测序，并分析测序结果。

4)定量反转录PCR(定量RT-PCR)验证：提取总RNA，制备反转录酶混合反应液其总体积20 μL。在PCR扩增仪进行反转录酶反应：16℃，30 min;42℃，42 min;85℃，5 min。反应结束后，将其放在－20℃保存。将所有cDNA样品分别配置Real time PCR反应体系。置于实时PCR仪上进行PCR反应，绘制熔解曲线，每一个mRNA的相对表达水平通过与内参(U6)对比进行标准化，并根据荧光曲线图计算样本Ct值。abca4的引物序列：5'-GAATCCTACATTACAGCGACCC-3'，3'-GTGGCAGGTAGAGGGTGAAAT-5';cd200的引物序列：5'-GTCTACCTACAGCCTGGTTTGG-3'，3'-AAGGTGATGGTTGAGTTTTGGA-5'。

1.3 统计学方法

本实验数据应用SPSS 16.0版本统计学分析软件进行分析，亚硫酸氢钠测序PCR测序分析和荧光定量PCR验证分析结果均采用独立样本t检验检测，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本组实验将正常组与疾病组芯片上甲基化探针的数据进行比较，利用t检验计算差异是否有统计学意义，将P值经取对数等处理后命名为DiffScore，按照Diffscore值＞20或＜－20的差异甲基化水平比较筛选2组的基因，共得到差异甲基化基因871条，其中甲基化程度升高的基因位点有352个，甲基化程度低的基因位点有519个。结果详见图1。

图1 人类心力衰竭患者23对染色体DNA甲基化芯片分析结果Fig.1 Results of whole genome methylation in heart failure patientsRed part：high methylation locus;Blue part：low methylation locus;.Green part：chromosomal centromere locus.

将差异甲基化对应的基因与mRNA表达谱分析得到的差异基因取交集，共得到13条基因，详见表1。

表1 疾病组与正常组差异甲基化与差异基因Tab.1 Differential methylation gene

选取abca4和cd200进行亚硫酸氢钠测序PCR (bisulfite sequencing PCR，BS-PCR)，并用荧光定量PCR验证对应基因表达量的改变。疾病组abca4基因启动子区甲基化率为85.5%，正常组基因启动子区甲基化率为91.2%(图2);疾病组基因启动子区甲基化率比正常组基因启动子区甲基化率低5.7%，疾病组cd200基因启动子区甲基化率为50.5%，正常组基因启动子区甲基化率为57.1%。

3 讨论

DNA甲基化是通过将S2腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，并在 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5'位置的氢被活性甲基所取代，从而转变成52甲基胞嘧啶。DNA甲基化具有多方面的生理意义，正常的甲基化对于维持机体的功能是必需的，如基因印记、X染色体失活、细胞分化、胚胎发育等［2］。DNA甲基化异常包括基因组DNA甲基化水平降低和局部CpG岛甲基化程度升高，即低甲基化和高甲基化。DNA甲基化异常主要指DNA高甲基化［3］。一般情况下，基因启动子区的CpG岛为非甲基化状态，当发生甲基化时，常导致基因表达减少或缺失。特定基因启动子区的异常高甲基化往往与肿瘤的形成和发展有关［2］。而癌基因低甲基化则会使相关基因高表达从而造成正常细胞生长分化调控失常［4-5］。而导致这些基因表达量改变的DNA甲基化的变化可能很轻微。有研究［6］显示小脑和大脑组织中rassf1基因甲基化6%的差异会导致基因表达量不同。Barrès R等［4］也报道pgc1a基因启动子区甲基化2% ～5%的不同会导致Ⅱ型糖尿病人股外侧肌中pgc1α基因表达量3.5倍的差异。乳腺癌患者中，atm基因甲基化8%的不同导致基因表达量1.5～3.5倍的差异［5］。

Movassagh M等［1］研究认为心力衰竭时同样存在着DNA甲基化的异常，并且他们发现不同的甲基化状态对应着基因的不同表达，pecam1基因5'区高甲基化基因本身则低表达;arhgap24基因的高甲基化其本身则高表达，而amotl2基因的低甲基化其本身则低表达，这可能与心力衰竭发生过程的细胞凋亡、钙离子信号失调，及心肌收缩异常、G蛋白受体表达下调和血管发生过程异常等病理过程有关。本课题组应用甲基化的方法高通量筛选心力衰竭组与正常对照组的基因组甲基化异常并与基因表达谱芯片筛选的疾病组和对照组间的差异基因取交集得到了13条异常的基因，选取abc4和cd200进行研究，从功能分析，abca4基因属于膜转运蛋白ATP-结合盒(ATP-binding cassette，ABC)家族转运体中A族的第4个成员，由47个外显子组成，基因位于染色体1p22上，该基因表达产物可能参与观光细胞中一种特殊分子的跨膜转运［7］。有研究［8］显示，在眼底黄色斑点症患者中存在abca4基因突变。同时，这一突变可能与视网膜色素变性19基因［9］(retinitis pigmentosa-19)和老年黄斑变性2基因［10-13］(macular degeneration age-related 2)有关。但是，目前认为abca4基因仅在视网膜感光细胞中表达，尚未在心肌细胞中发现abca4基因的编码蛋白［14］。cd200基因编码蛋白是一种Ⅰ-型膜糖蛋白，由6个外显子组成，基因位于染色体3q12-q13上［15］，胞膜外区有两个免疫球蛋白样结构域，属于免疫球蛋白超家族，广泛地表达在组织中［16］，在多种B细胞来源的血液肿瘤中高表达［17］，并与雄激素性脱发患者毛囊细胞成熟过程有关［18］。cd200具有介导T细胞共刺激信号、促进T细胞增生、使Ⅰ-型细胞因子减少、2型细胞因子增加的作用。cd200蛋白在免疫疾病、抑制排斥反应及肿瘤生长过程中作为一种免疫耐受信号［15］，发挥免疫调节的作用［19］。

总之，本课题组的研究表明心衰时DNA启动子区甲基化状态会发生改变，本课题组的研究只是初步揭示了DNA甲基化在心力衰竭时的改变，而DNA甲基化究竟如何在心力衰竭的发生、发展过程中起作用，及究竟哪些基因位点发生了甲基化目前还不清楚，尚待期待着进一步的研究来揭示这一奥秘。

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