脂联素基因多态性与2型糖尿病合并冠心病的关联研究

南 楠 金泽宁* 杨 泽

(1.首都医科大学附属北京安贞医院心血管内科，北京市心肺血管疾病研究所，北京100029; 2.卫生部北京医院，老年医学研究所遗传室，北京100730)

根据美国心脏病协会(American Heart Associa- tion，AHA)2010年的报告［1］，由于积极地进行危险因素的干预，心血管事件的发生率在过去的20年间降低了50%左右，但尽管如此，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者中冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease，CAD，以下简称冠心病)的发生率和病死率的绝对危险度仍然是非2型糖尿病者的2倍左右［发病率的风险比(hazard ratio，HR)女性为2.5，男性为2.4，女性患者病死率的HR为2.2，男性为1.7］［1-3］。白种人ADIPOQ基因多态性与2型糖尿病合并冠心病关联［4-7］。但白种人与中国人有遗传异质性。本研究探讨ADIPOQ基因多态性在中国2型糖尿病人群中与冠心病的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2007年2月至2009年5月北京安贞医院心内科住院患者，冠状动脉造影结果显示左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉至少1支狭窄≥50%，诊断为冠心病;并且符合1999年WHO糖尿病诊断标准［1］，作为2型糖尿病合并冠心病组，共213例。选取2008年1月至2009年10月卫生部北京医院内分泌科门诊患者符合1999年WHO糖尿病诊断标准［1］且无冠心病病史者，作为2型糖尿病对照组，共467例，获得所有研究对象知情同意。

1.2 标本采集

清晨空腹排空膀胱后测量身高、体质量、血压、静脉空腹血脂、血糖、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HBA1c)、尿酸、肌酐、尿素氮等指标，记录研究对象年龄、性别，留取5 mL EDTA抗凝静脉血，盐析法［8］提取DNA。采用Nanodrop ND-1000分光光度计对dsDNA进行质量控制，将所有样本的dsDNA浓度标化至70～90 ng/μL之间，4℃保存备用。

1.3 预实验

本研究首先对20例2型糖尿病合并冠心病患者进行ADIPOQ基因第2个外显子区域测序，测序引物设计应用Oligo 7.0软件(Molecular Biology Insights，Inc.)，上游引物序列：5'-GAAAGAACCAGCCAAGGAGTGAGA-3'，下游引物序列：5'-GGGAATAGGGATGAGGGTGAAGAT-3'，产物片段长度为1 283 bp，由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。聚合酶链式反应(PCR)50 μL体系为：模板10 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶2.5 μL，10× Buffer 5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，加去蒸馏水至50 μL。在PTC-225PCR仪上进行PCR，其反应条件为：首先95℃预变性5 min后，95℃变性1 min，64.4℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环，最后72℃延伸7 min。将1 283 bp目的片段用于测序，由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。将20例T2DM+ CAD组患者的测序结果与Human(GRCh37)的ADIPOQ基因的序列，应用Megalign软件的Clustal W方法进行序列拼接，将突变频率大于0.05的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)作为候选基因的SNPs。

1.4 大样本量复制研究

将预实验筛选出的候选SNPs在213例2型糖尿病合并冠心病以及467例单纯2型糖尿病患者进行基因频率分布的比较。基因分型基于高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)小扩增子法。

1)引物设计：应用LightScanner引物设计软件对rs2241766多态性进行引物设计，引物序列为：上游引物：5'-CTGGGAGCTGTTCTACTG-3'，下游引物：5'-CT TGAGTCGTGGTTTCCT-3'。高温内参：5'-GCGCGGCC GGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTG CGGAAGCGGAGGGGCGGGC-3'，低温内参：5'-TTAAA TTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAA TATAATAC-3'。

2)PCR反应体系(10 μL)：DNA模板1 μL，0.01 mmol/L dNTP 0.2 μL，TaqDNA聚合酶1 U，10×PCR缓冲液1.0 μL，0.01 mmol/L扩增引物0.2 μL(上游引物和下游引物各0.1 μL)，0.01 mmol/L寡核苷酸内参0.2 μL(高温寡核苷酸内参与低温寡核苷酸内参各0.1 μL)，LCGreen饱和荧光染料0.8 μL，去离子水6.4 μL补充至总体积为10 μL。

3)反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，58.4℃复性30 s，延伸6 s，共55个循环，72℃总延伸7 min。

4)再进行变性复性处理：95℃30 s，25℃2 min，94℃ 30 s，24℃ 4 min。

5)HRM检测：LightScanner仪器从45℃开始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，至98℃结束，用LightScanner Call IT 2.0软件对采集后的曲线进行分析，确定基因型。

6)测序验证：对HRM分析的不同基因型进行测序验证，以确保结果的准确性。rs2241766T/G多态性的熔解曲线见图1。

图1 应用高分辨率熔解曲线分析法检测rs2241766T/G序列突变Fig.1 Genotyping of rs2241766T/G polymorphism by high resolution melting analysisA：shifted melting peaks，the internal temperature calibrators are designed to melt at 60.33℃(low Cal-1)and 92.0℃(high Cal-1);B：normalized melting peaks.The genotypes(TT/TG/GG)could be clearly distinguished.

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较用t检验，计数资料以率表示，组间比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 预实验结果

20例极端表型病例(2型糖尿病合并冠心病)和 45例参考数据库中国汉族北京人的序列拼接比较，在ADIPOQ基因中发现5个SNPs，包括rs17366568G/A、9882205G/A、2241767A/G、1501299G/T、2241766T/ G。以rs2241766T/G多态性为例，其拼接及测序结果见图2、图3。各个SNPs位点基因分型结果，见表1。初步预实验发现2个位点与2型糖尿病合并冠心病关联，包括rs2241766T/G多态性［OR(95%CI)=2.78(1.20～8.65)，P=0.015］和rs9882205G/A多态性［OR(95%CI)=3.9(1.78～13.61)，P=0.001］。

表1 预实验中脂联素基因的5个SNPs分布情况Tab.1 The distributions of 5 SNPs in ADIPOQ gene in pilot study

2.2 基线情况

213例2型糖尿病合并冠心病(病例组)以及467例单纯2型糖尿病患者(对照组)临床基线数据见表2。病例组男性患者比例、体质量指数、收缩压、舒张压、总胆固醇、糖化血红蛋白均高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL)低于对照组。年龄、肌酐、尿酸、空腹血糖以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL)在两组间差异无统计学意义。

表2 病例组(T2DM+CAD)及对照组(CAD)临床基线数据Tab.2 Clinical baseline of case group(T2DM+CAD)and control group(T2DM)

2.3 大样本量复制研究结果

对rs2241766(+45T＞G)多态性进行扩大样本量的研究。两组基因型及等位基因分布见表3，2型糖尿病对照组基因型分布观察值与期望值差异无统计学意义(P＞0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明样本来自一个随机婚配平衡状态的群体，具有代表性。在2型糖尿病患者中，rs2241766多态性与冠心病风险无关。

3 讨论

糖尿病是冠心病的高危合并症［9］。一系列遗传关联研究和家族聚集性研究［10-12］表明糖尿病合并冠心病的易感性50%是遗传因素导致的。脂肪细胞大量地分泌脂联素，其在2型糖尿病的发生以及冠心病进程中发挥保护作用，通过直接激活AMP激活蛋白酶(AMP kinase，AMPK)通路［13］。脂联素在糖代谢中主要的作用是通过AMPK途径激活PPARα，后者增加葡萄糖的摄取并降低肝糖原的输出。脂联素在CAD中的保护性效应通过激活心肌细胞AMPK信号通路，并且通过环氧化酶2(cycloxygenase-2，COX2)产生前列腺素E2［14］。Cao Y等［15］发现通过干预直接增加血浆脂联素水平，可能改善内皮功能，并且降低糖尿病患者心血管合并症的发生。Fox C S等［3］发现在2型糖尿病患者中，合并冠心病患者血浆脂联素水平较低。

表3 脂联素基因rs2242766(+45T/G)多态性在病例组与对照组间分布Tab.3 Comparison of distribution of ADIPOQ rs2241766 (+45T/G)polymorphism in case and control groups

脂联素(adiponectin，ADIPOQ)基因位于人体第3号染色体3q27区，包括3个外显子和2个内含子，全长 15.77 kb，编码区为 4.599 kb。 +45T＞G (rs2241766)位于第2个外显子，为同义突变，Qi L等［4］发现对于rs2241766而言，G等位基因携带者与AA基因型者相比，血浆脂联素水平无明显差异。

越来越多的数据［4-7，16-17］表明ADIPOQ基因突变在糖尿病患者中与冠心病相关。但结果却不尽一致。Lacquemant C等［7］在法国和瑞士的2型糖尿病患者队列研究中，通过对162例糖尿病合并冠心病病人以及315例糖尿病对照患者比较后发现，无论是2个队列单独比较，还是将两组合并，rs2241766(+45T＞G)与冠心病关联。与TT纯合子相比，GG纯合子和GT杂合子组合升高患冠心病的风险(OR=2.0;95% CI：1.3～3.2;P=0.020)。而在之后的研究中，如意大利、日本以及美国糖尿病患者队列研究［4-6，16］中并未发现rs2241766与冠心病的关联。马晓伟等［17-18］在中国人群159例2型糖尿病合并冠心病病例，以及3本研究首先通过对20例拥有极端表型(2型糖尿病合并冠心病)患者进行ADIPOQ基因第2个外显子测序，结果发现 rs2241766多态性 G等位基因增加T2DM合并CAD风险［OR(95%CI)=2.78(1.20～8.65)，P=0.015］，然而在大样本量复制研究中未发现rs2241766T/G多态性与T2DM、CAD或T2DM合并CAD关联的趋势。与大多数队列研究结果一致。因此，rs2241766T/G多态性可能不是影响2型糖尿病患者发生冠心病的危险因素。

对于2型糖尿病对照组的选择差异可能是导致各项研究结果不一致的原因。Lacquemant C等［7］、Bacci S等［6］、Ohashi K等［16］通过心绞痛病史，并且静息心电图正常排除冠心病;Qi L等［4-5］则进行前瞻性研究，通过随访心血管事件明确或排除冠心病;马晓伟等［17］则是通过冠状动脉造影阴性来排除冠心病，但导致对照组样本量少于病例组;本研究通过冠状动脉造影明确冠心病而通过无心绞痛病史排除冠心病，而无排除冠心病的客观证据，可能存在一定误差。

［1］ Lloyd-Jones D，Adams R J，Brown T M，et al.Heart disease and stroke statistics——2010 update：a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2010，121 (7)：e46-e215.

［2］ Preis S R，Hwang S J，Coady S，et al.Trends in all-cause and cardiovascular disease mortality among women and men with and without diabetes mellitus in the Framingham Heart Study，1950 to 2005［J］.Circulation，2009，119(13)：1728-1735.

［3］ Fox C S，Hwang S J，Coady S，et al.Trends in cardiovascular complications of diabetes［J］.JAMA，2004，292 (20)：2495-2499.

［4］ Qi L，Doria A，Manson J E，et al.Adiponectin genetic variability，plasma adiponectin，and cardiovascular risk in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes，2006，55(5)：1512-1516.

［5］ Qi L，Li T，Rimm E，et al.The+276 polymorphism of the APM1 gene，plasma adiponectin concentration，and cardiovascular risk in diabetic men［J］.Diabetes，2005，54 (5)：1607-1610.

［6］ Bacci S，Menzaghi C，Ercolino T，et al.The+276 G/T single nucleotide polymorphism of the adiponectin gene is associated with coronary artery disease in type 2 diabetic patients［J］.Diabetes Care，2004，27(8)：2015-2020.

［7］ Lacquemant C，Froguel P，Izzo P，et al.The adiponectin gene SNP+45 is associated with coronary artery disease in Type 2(non-insulin-dependent)diabetes mellitus［J］.Diabet Med，2004，21(7)：776-781.

［8］ Nasiri H，Forouzandeh M，Rasaee M J，et al.Modified salting-out method：high-yield，high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent［J］.J Clin Lab Anal，2005，19(6)：229-232.

［9］ Haffner S M，Lehto S R，Nnemaa T，et al.Mortality from coronary heart disease in subjects with type 2 diabetes and in nondiabetic subjects with and without prior myocardial infarction［J］.N Engl J Med，1998，339(4)：229-234.

［10］Ordovas J M.Genetic links between diabetes mellitus and coronary atherosclerosis［J］.Curr Atheroscler Rep，2007，9 (3)：204-210.

［11］Fumeron F，Reis A F，Velho G.Genetics of macrovascular complications in diabetes［J］.Curr Diab Rep，2006，6(2)：162-168.

［12］Barakat K，Hitman G A.Genetic susceptibility to macrovascular complications of type 2 diabetes mellitus［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2001，15(3)：359-370.

［13］Kawano J，Arora R.The role of adiponectin in obesity，diabetes，and cardiovascular disease［J］.J Cardiometab Syndr，2009，4(1)：44-49.

［14］Ferrarezi D A，Cheurfa N，Reis A F，et al.Adiponectin gene and cardiovascular risk in type 2 diabetic patients：a review of evidences［J］.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007，51(2)：153-159.

［15］Cao Y，Tao L，Yuan Y，et al.Endothelial dysfunction in adiponectin deficiency and its mechanisms involved［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46(3)：413-419.

［16］Ohashi K，Ouchi N，Kihara S，et al.Adiponectin I164T mutation is associated with the metabolic syndrome and coronary artery disease［J］.J Am Coll Cardiol，2004，43(7)：1195-1200.

［17］Ma X W，Lin Y H，Li J P，et al.Adiponectin gene polymorphisms are associated with the risk of coronary artery disease in Chinese type 2 diabetic patient［J］.Chin J Diabetes，2008(04)：197-200.

［18］马亚红，冼勋德，杨俊芬，等.2型糖尿病HDL26的变化特点及时预测冠心病风险的意义［J］.首都医科大学学报，2011，32(5)：609-613.