sRAGE对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响

张 敏 郭彩霞* 曾翔俊 王红霞 张立克 杜凤和

(1.首都医科大学附属北京天坛医院心内科，北京100050;2.首都医科大学基础医学院病理生理教研室，北京100069)

研究［1］发现心肌缺血/再灌注损伤可以调动心脏自身保护机制，内源性保护物质的释放在心脏自身保护中的作用尤其被关注。晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，和其配体在细胞表面结合，激活细胞内多种信号转导机制，参与糖尿病及其慢性合并症［2］、炎性反应［3］、肾衰竭［4］、心力衰竭［5］、肿瘤生长［6］及神经元分化等多种生理和病理过程。可溶性晚期糖基化终产物(soluble form of receptor for advanced glycation end products，sRAGE)是RAGE的细胞外段部分，可特异结合AGEs，但由于不具有胞内段部分，不能进行信号转导，从而中断上述生物效应对抗多种疾病和病理过程。有研究［7］显示sRAGE可以减轻心脏缺血/再灌注损伤。本课题组前期大体实验［8］也证实内源性sRAGE减少和缺血/再灌注损伤有关，但作用机制尚未明了。其是否直接作用于心肌细胞?是否通过影响氧化应激而发挥作用尚未见报道。

故本文采用缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)大鼠心肌细胞损伤模型，证实外源性sRAGE直接作用于心肌细胞，通过干扰氧化应激，进而拮抗缺血/再灌注损伤而发挥心肌保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与仪器、试剂

新生(48 h以内)SD大鼠-雌雄不分〔购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号：SCXK(京)2006-0009〕;超净工作台(上海博讯医疗设备厂);细胞培养箱(Recvo公司，美国);倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本);DMEM培养基(Gibco公司，美国);优等胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);胶原酶I、胶原酶Ⅱ(Sigma公司，美国);胰蛋白酶(Hyclone公司，美国);丝裂霉素C(Roche公司，美国);酶标仪(Biorad公司，美国);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司，美国);Cytotoxicity Detection Kit (LDH)(Roche公司，美国);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光染料(Sigma公司，美国);流式细胞仪(Bechman Coulter公司，美国);sRAGE(北京爱迪博生物科技有限公司)。

1.2 心肌细胞H/R模型制备

采用大鼠原代心肌细胞培养［9］：新生大鼠，消毒胸腹部，开胸，摘取2/3心脏，剪碎(1 mm3)，消化酶反复消化，收集上清液，离心(1 000 r/min，10 min)，细胞重悬，于5%CO2、37℃条件下差速贴壁30 min，收集细胞悬液加入丝裂霉素C(2g/mL)，根据实验所需将细胞接种到培养瓶或培养板中。24 h后第1次细胞换液，72 h后用于实验。

复制心肌细胞缺氧/复氧损伤模型：将72 h细胞放入自制的缺氧罐内，通入混合气体(2%O2、5% CO2、93%N2)3 h后，将细胞取出，放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养2 h。

实验分组：①常氧组(Con)：细胞正常培养5 h;②常氧+sRAGE组(Con-sRAGE)：细胞培养基中加入sRAGE余处理同Control组;③ 缺氧/复氧组(H/ R);④ 缺氧/复氧+sRAGE(H/R-sRAGE)组(实验组)：向细胞培养基中加入sRAGE后处理同H/R组。实验结束时分别留取心肌细胞培养液及心肌细胞。

1.3 观察指标及测定方法

1.3.1 MTT比色法测定心肌细胞活力

筛选 sRAGE干预适宜浓度：不同浓度梯度sRAGE干预H/R心肌细胞(H/R组、H/R+sRAGE 300 ng/mL组、H/R+sRAGE 600 ng/mL、H/R+ sRAGE 900 ng/mL、H/R+sRAGE 1 500 ng/mL、H/R +sRAGE 2 100 ng/mL)接种于96孔板中处理后，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37℃继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，摇床缓慢振荡10 min，使结晶物完全溶解。用酶联免疫检测仪选择490 nm波长检测各孔吸光度值。

1.3.2 细胞上清LDH漏出含量测定

筛选 sRAGE干预适宜浓度：不同浓度梯度sRAGE干预H/R心肌细胞(分组同MTT)接种于96孔板中处理后，取各组细胞上清液50 μL，按试剂盒操作方法测定LDH。

1.3.3 细胞上清SOD活力、MDA含量测定

各组心肌细胞分别处理后，取细胞上清，分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法测定SOD、MDA，具体实验步骤按试剂盒操作说明。

1.3.4 DCFH-DA探针借助流式细胞仪检测细胞内ROS水平

各组对数生长期心肌细胞分别处理后，弃去培养基，25 mmol/L HEPES洗 2遍;加入 5 μmol/L的DCFH-DA荧光染料100 μL，37℃避光负载30 min; HEPES洗2遍;加入胰酶消化细胞，1 100 r/min、室温、离心8 min;弃去培养基，HEPES洗2遍，离心;弃上清，加入400 μL HEPES，在流式细胞仪上(激发波长488 nm、发射波长525 nm)以FS和SS为参数，选取活细胞，将其限定在Gate内，进行分析。得到荧光强度值(MIF)所测MIF值与ROS含量呈否比。

1.3.5 细胞上清NO含量测定

各组心肌细胞分别处理后，取细胞上清，采用硝酸还原酶法测定NO含量，具体实验步骤按试剂盒操作说明。

1.4 统计学方法

应用SPSS16.0统计软件进行数据分析。实验数据以均值±标准误(±SE)表示，各组间计量资料的比较采用单因素方差(one way ANOVA)分析，差异有统计学意义，则采用最小显著差(least significant difference，LSD)法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 给予sRAGE对心肌细胞活力及LDH的影响

与H/R组相比，给予不同浓度sRAGE可以改善心肌细胞活力，在900 ng/mL时趋势最明显，差异有统计学意义(图1)(P＜0.01)。与H/R组相比，予以外源性sRAGE 900 ng/mL时LDH的漏出量最少，差异有统计学意义(图2)(P＜0.01)。

2.2 心肌细胞上清MDA含量、SOD活力

900 ng/mL sRAGE干预培养细胞的 SOD和MDA，与H/R组相比，实验组MDA含量减少(P＜0.01)，SOD活力增强(P＜0.05)(图3、4)。

2.3 心肌细胞内ROS活性及培养基NO水平

给予900 ng/mL RAGE后。与H/R组相比，实验组荧光强度降低，即ROS含量降低(P＜0.05)(图5)。

与H/R组相比，H/R-sRAGE组NO含量降低(P＜0.01)(图6)。

3 讨论

随着冠状动脉溶栓、介入和搭桥等内外科冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)治疗手段的迅速开展，防治心肌缺血/再灌注损伤成为研究的重点［10］。心脏缺血/再灌注损伤机制复杂［11］，涉及自由基增多、钙超载、中性粒细胞激活、心肌细胞凋亡、血管内皮功能障碍、能量代谢障碍等。目前普遍认为活性氧大量产生引发的心肌氧化应激在缺血/再灌损伤的病理过程中发挥重要作用［12］。心肌缺血/再灌注损伤过程中产生大量氧自由基，引发链式脂质过氧化反应，损伤膜系统，促使细胞发生氧化损伤，膜通透性及流动性改变;使具有酶活性的蛋白质活性丧失或减弱。而这些损伤可能影响到心肌组织的功能，如能量代谢、离子电流、心肌收缩等方面。

晚期糖基化终产物受体(RAGE)属于多配体受体，表达于心肌细胞的细胞膜上，在成熟的动物及人体中呈低水平表达、当细胞处于激活或应激状态，如糖尿病、炎性反应，受损细胞中RAGE的表达急剧增高。RAGE与晚期糖基化终产物(AGEs)结合，致多个信号传导途径的激活，介导生物效应。sRAGE是RAGE的细胞外段部分，通过RAGE自分泌及基质金属蛋白酶解作用形成，存在于循环血液中，可与细胞膜上的RAGE竞争AGEs，干扰AGEs-RAGE相互作用，由于不具有胞内段部分，不能进行信号转导，所以不介导生物效应，从而拮抗糖尿病慢性合并症、动脉粥样硬化、高血压、缺血再灌注损伤、全身炎性反应综合征、阿尔茨海默病、衰老、癌症等疾病和病理过程的进展。

图6 给予900 ng/mL sRAGE后细胞上清NO含量Fig.6 NO Content in medium*P＜0.01 vs control，#P＜0.01 vs H/R;sRAGE：soluble form of receptor for advanced glycation end products;NO：nitigen monoxide;H/R：hypoxia/reoxygenation.

Falcone C［13］等研究证实在校正了危险因素后，血清中sRAGE低水平与冠状动脉疾病危险性升高相关;本课题组前期的实验结果［8］显示，内源性sRAGE在常氧组和缺氧/复氧组心肌细胞无差别，但sRAGE下降的根本机制尚不清楚，我们认为其原因可能是内源性sRAGE的生成是神经、体液、心肌细胞共同调节的。本研究采用培养乳鼠心肌细胞，缺氧3 h/复氧2 h造成心肌缺氧/复氧损伤，与H/R组相比，予以不同浓度sRAGE组，心肌细胞活性增加，LDH漏出量减少，LDH漏出量多少可反映细胞膜的损伤，其外漏的程度也可间接反映心肌再灌注受损程度，说明外源性sRAGE直接作用于心肌细胞产生保护性作用，并在900 ng/mL时作用最明显(P＜0.01)。

鉴于自由基增多是造成再灌注损伤的主要机制，我们观察sRAGE是否通过影响氧自由基而发挥作用。MDA是脂质过氧化的共同产物，细胞中MDA含量常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映心肌细胞受自由基攻击的严重程度和细胞损伤的程度; SOD能清除氧自由基，阻断脂质过氧化的链式反应，SOD活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。MDA和SOD是评价心肌缺血损伤的公认指标。由于在复灌阶段，缺血部位的心肌会受到生化物质的突然改变及能量代谢变化的影响。这些变化包括大量ROS产生，线粒体功能异常，心肌细胞内钙离子超载及其他调控机制的异常［14］。在缺血复灌阶段，大量ROS的产生引起心肌细胞氧化应激，导致不可逆转的细胞损伤甚至细胞死亡。本研究表明，与H/R组相比，H/R+sRAGE组可以显著降低MDA含量，升高SOD活力，减少细胞内ROS含量，说明sRAGE能抑制脂质过氧化过程，增强清除氧自由基的能力，降低原代心肌细胞缺氧/复氧所致的胞内ROS升高，提示sRAGE可能通过降低氧化应激来拮抗心肌H/R损伤。这与文献［15］报道的结论一致。

心脏缺血/再灌注损伤诱发NO生成，受NOS调控，NO是一种新型氧自由基，过量的NO可通过产生细胞毒性作用，参与强毒性氧自由基的形成;抑制多种与细胞代谢有关的酶，直接损伤DNA，促进细胞凋亡等途径造成或加重组织、细胞损伤。本实验研究结果显示，与H/R组相比，实验组NO含量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示sRAGE对H/R心肌细胞的保护作用与减少NO的生成有关，从而减少了NO的损伤作用。这与体外实验结果：sRAGE可能通过干扰NOS途径减轻对缺血/再灌注心肌造成损伤的结果相符。NO的生成受eNOS和iNOS共同调控，sRAGE对H/R心肌细胞NO生成的影响究竟是通过干扰何种NOS而产生的，尚不清楚，有待进一步研究。

综上所述，外源性sRAGE可以直接作用于H/R心肌细胞产生保护性作用，其机制可能与抑制氧化应激有关;但其是否还通过其他机制拮抗缺血/再灌注损伤而发挥心肌保护作用，值得进一步探讨。

［1］ Zhao Z Q，Corvera J A，Halkos M E，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physial，2003，285(2)：H579-588.

［2］ Tam X H，Shiu S W，Leng L，et al.Enhanced expression of receptor for advanced glycation end-products is associated with low circulating soluble isoforms of the receptor in Type 2 diabetes［J］.Clin Sci(Lond)，2011，120(2)：81-89.

［3］ Mauri T，Masson S，Pradella A，et al.Elevated plasma and alveolar levels of soluble receptor for advanced glycation endproducts are associated with severity of lung dysfunction in ARDS patients［J］.Tohoku J Exp Med，2011，222(2)：105-112.

［4］ Yan S F，Yan S D，Ramasamy R，et al.Tempering the wrath of RAGE：an emerging therapeutic strategy against di-abetic complications，neurodegeneration，and inflammation［J］.Ann Med，2009，41(6)：408-422.

［5］ Raposeiras-Roubin S，Rodino-Janeiro B K，Grigorian-shamagian L，et al.Relation of soluble receptor for advanced glycation end products to predict mortality in patients with chronic heart failure independently of Seattle Heart Failure Score［J］.Am J Cardiol，2011，107(6)：938-944.

［6］ Jiao L，Taylor P R，Weinstein S J，et al.Advanced glycation end products，soluble receptor for advanced glycation end products，and risk of colorectal cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20(7)：1430-1438.

［7］ Bucciarelli L G，Kanekom，Ananthakrishnan R，et al.Receptor for advanced-glycation end products：key modulator of myocardial ischemic injury［J］.Circulation，2006.113 (9)：1226-1234.

［8］ 董洪武，郭彩霞，杜凤和，等.缺血/再灌注损伤对大鼠心肌内源性可溶性糖基化终末产物受体分泌的影响［J］.首都医科大学学报，2011，32(5)：640-644.

［9］ 郭军，鲍翠玉，林国生，等.新生大鼠心肌细胞培养方法的改进［J］.血管康复医学杂志，2006，15(6)：538-554.

［10］李卓，谷天祥，张玉海.兔改良心肌缺血模型的建立［J］.中国医科大学学报，2010，39(9)：740-742.

［11］宝鲁尔.心肌缺血再灌注损伤发生机制研究进展［J］.内蒙古民族大学学报，2009，15(2)：126-127.

［12］Gao Q，Yang B，Ye Z G，et al.Opening the calcium-activated potassium channel participates in the cardioprotective effect of puerarin［J］.Eur J Pharmacol，2007，574(2－3)：179-184.

［13］Falcone C，Emanuele E，D'Angelo A，et al.Plasma levels of soluble receptor for advanced glycation end products and coronary artery disease in nondiabetic men［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(5)：1032-1037.

［14］Yellon D M，Hausenloy D J.Myocardial reperfusion injury［J］.N Engl J Med，2007，357(11)：1121-1135.

［15］Devangelio E，Santilli F，Formoso G，et al.Soluble RAGE in type 2 diabetes：association with oxidative stress［J］.Free Radic Biol Med，2007，43(4)：511-518.