脂肪酶及其在饲料中的应用

河南省科学院生物研究所 刘德海 解复红 贾 彬

河南省工业酶工程技术研究中心 陈国参 权淑静 马焕

脂肪酶又称甘油酯水解酶，能够催化天然底物油脂的分解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，其天然底物是生物产生的天然油脂，是最早被研究的酶类之一，作用于异相系统，即在油水界面上水解脂肪酸甘油酯，而只有当底物以微粒、小聚合分散状态或成乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶被广泛应用于食品、生物、饲料等领域，在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。

1 脂肪酶的来源

脂肪酶普遍存在于动物、植物组织和多种微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽等，当油料作物种子发芽时，脂肪酶能与其他酶协同发挥作用催化分解油脂类物质，为种子生根发芽提供所必需的养料和能量；动物胰脏和脂肪组织内含大量脂肪酶，动物消化道内脂肪酶主要包括十二指肠前脂肪酶和十二指肠内的胰脂肪酶。十二指肠前脂肪酶指来源作用于动物的胃和口腔，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足；胰脂肪酶是由胰腺合成分泌的一种中性脂肪酶，其经胰管流入十二指肠内对脂肪起到消化分解的作用。而微生物脂肪酶种类最多，含量最为丰富，广泛存在于细菌、霉菌和酵母中。

2 脂肪酶的性质

由于脂肪酶产生菌种类众多，不同微生物生产的脂肪酶结构、性质等差异较大。脂肪酶基本组成为氨基酸，其催化活性决定于其蛋白质结构，这种结构催化脂肪水解的多肽链，一般情况下折叠为N-末端和C-末端两个结构领域，N-末端有结合脂肪酸的疏水通道，活性部位由组氨酸、丝氨酸与天冬氨基酸组成。脂肪酶分子质量的大小因其来源不同而存在很大差异，不同来源脂肪酶的氨基酸组成数目为270～641，其分子质量为29～100 kD；脂肪酶的性质研究主要包括最适作用温度与pH，脂肪酶最适作用温度因其来源不同而差异很大，按最适作用pH可分为酸性、中性和碱性脂肪酶；最适反应温度一般在30～60℃，最适作用pH为4～10，不同来源脂肪酶的最适反应温度和作用pH差异也较大。来自于细菌的脂肪酶最适pH在中性或碱性范围内；来自于真菌的脂肪酶最适pH为4～10，最适反应温度较低。脂肪酶在底物浓度下处于溶解状态，不表现酶活性或作用极其缓慢；只有当底物浓度增加到超出其极限溶解度达到过饱和状态时，才被激活表现出明显的活性，这种现象称为“界面活化现象”。

3 脂肪酶的生产

脂肪酶的生产方法有三种，即化学合成法（通过分析酶的氨基酸组成顺序，然后用化学方法合成）、提取法（从动植物器官或组织中提取）、生物发酵法（利用微生物发酵获得）。化学合成法和提取法因试验技术等客观条件而受到限制，微生物脂肪酶种类多，微生物发酵法成为脂肪酶主要生产方法，由于微生物资源丰富，并且种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH和作用温度范围，且微生物来源的脂肪酶一般均是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，生产不受自然环境的影响，可通过人工控制来大量生产目的酶，此外，其生产周期短，生产成本低，是一种经济而实用的方法，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。脂肪酶在微生物中具有广泛的分布，已知大约有2%的微生物产脂肪酶，其产生菌包括细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属，至少65个属的微生物产脂肪酶。近年来，微生物脂肪酶的研究主要集中在高产菌株的选育、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺优化、酶的分离纯化及工业化生产；提高脂肪酶酶活性的方法有诱变育种、构建基因工程菌及优化发酵工艺，利用分子生物学筛选脂肪酶高产菌株、通过基因工程克隆脂肪酶基因而大幅度提高脂肪酶产量成为主要手段。贾彬等（2010）克隆了洋葱伯克霍尔德菌，实现其在毕赤酵母中快速稳定的表达。脂肪酶产酶菌株的筛选主要利用培养平皿的生化反应进行分离初筛，其主要方法有以下三种：（1）Rhodamine B平板筛选法。脂肪在脂肪酶的水解作用下，产生甘油和脂肪酸，脂肪酸和Rhodamine B的阳离子发生作用，生成黄色的荧光物质，紫外灯下观察，产脂肪酶的菌株周围会产生荧光圈，依据荧光圈的大小进行菌株的筛选；（2）溴甲酚紫平板筛选法。溴甲酚紫作为一种显色剂，其pH为5.2～6.8，在碱性条件下显紫色，酸性条件下显黄色，脂肪在脂肪酶的作用下产生的脂肪酸会使培养基pH降低，产脂肪酶菌株的周围会出现黄色的透明圈，根据透明圈的有无和大小来筛选产脂肪酶的菌株，透明圈越大说明产脂肪酶的能力越强；（3）琼脂块培养法。将分离的培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约6 cm的小琼脂块，排放在干净的培养皿内，将挑选的菌株接种在小琼脂块上培养，让其充分生长，然后依次再将长满菌落的小琼脂块放在酶活测定板上，28℃培养1～3 d，观察各菌落周围油脂水解圈的大小，在给定的时间内，脂肪酶活力的大小与其催化水解生成脂肪酸的量成正比，将水解圈大的菌株纯化后保藏在斜面培养基上。工业化生产的脂肪酶主要是微生物脂肪酶，包括细菌脂肪酶和真菌脂肪酶，细菌脂肪酶大多是胞外酶易于进行液体深层发酵，发酵易于控制，不易污染杂菌，生产效率高，其主要生产菌有假单胞菌属、芽孢杆菌属等；真菌脂肪酶具有温度及酸碱稳定性强、发酵设备简单、提取成本低等优点，其主要生产菌有曲霉属、假丝酵母等。首先运用基因工程技术实现产业化生产脂肪酶是丹麦Novo公司，Novo将柔毛腐质霉碱性脂肪酶基因克隆出工程菌株米曲霉应用于发酵生产，脂肪酶产量提高约1000倍（汪小锋等，2008）。但有关饲料专用酸性脂肪酶的工业化生产少有报道。

4 脂肪酶的检测

脂肪酶的测定方法很多，根据原理不同主要有正乙烷抽提法、酸碱滴定法、分光光度法（铜皂显色法、对硝基苯酯法）。中华人民共和国行业标准 《工业酶制剂通用试验方法QB/T 1803-93》中规定了脂肪酶的检测方法，酶活力定义为：1 g固体酶粉，于40℃，pH 7.5条件下，水解脂肪每分钟产生1 μmol的脂肪酸，即为1个脂肪酶国际单位，以U/g表示，其原理是：脂肪酶在一定条件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二脂、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸，可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示液指示反应终点，根据反应消耗的碱量，计算其酶活力。饲料用酸性脂肪酶酶活性的检测报道较少，这与饲用脂肪酶研究应用较晚还处于起步阶段有关，饲料用脂肪酶必须对胃肠道的酸性条件有一定的耐受性，并且在酶作用位点的pH范围内具有较高的活性，稳定性好；检测脂肪酶活性时反应温度、酸碱性要尽量接近畜禽体内温度及pH，这样才能真实反应出脂肪酶在畜禽肠道内的作用情况。随着饲用脂肪酶应用日益广泛，酶活力检测显得极为重要，寻找合适的测定方法是关键。

5 脂肪酶在饲料中的应用

脂肪参与动物机体的组成，是动物必需的营养物质，是畜禽体内主要能量物质，是机体最大的能量储备库，当机体需要能量时，体内脂肪在脂肪酶的作用下被分解，参与能量代谢，保证其健康生长，并可满足畜禽特殊生长阶段对高能量的需求。张照喜和马玉胜（1997）试验表明，夏季在肉仔鸡日粮中添加适量动物脂肪可以有效缓解热应激，提高仔鸡的采食量，改善饲料利用率和经济效益。蔡泽华和郭建同（2000）研究发现，在30日龄肉鸡日粮中添加3%棕榈油可明显提高其日增重和饲料利用率。另外，在动物饲料中添加脂肪可以改善饲料外观油性，减少饲料加工过程中的粉尘污染，同时可增加动物的食欲及其对脂溶性物质的吸收。张镇福等（2001）试验证明，油脂可以促进脂溶性维生素和叶黄素的吸收利用。动物饲料中的脂类必须经脂肪酶分解成脂肪酸、甘油二脂、甘油单酯后，才能被畜禽机体消化、吸收和利用，在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程。目前商品化生产的脂肪酶产品，其pH稳定性多在中性或碱性范围内，对酸的耐受性较差，而添加于饲料中的脂肪酶必须要经过胃肠道的酸性环境才能达到内源酶的水解作用位点，并能够在作用位点的pH范围内具有较高的活性，因此，绝大多数脂肪酶不适用于饲料。Polin等（1980）在含4%动物油的白来航公鸡玉米基础日粮中添加0.1%的胰脂肪酶，结果表明，添加胰脂肪酶能够提高脂肪的吸收，但效果不显著，原因可能是在肠道酸性条件下，不耐酸的胰脂肪酶容易失活，其到达主要作用位点（十二指肠）时活力较低。王琰等（2011）对饲料用耐酸性脂肪酶进行研究，初步建立了具有当地特色的微生物脂肪酶菌种库，酸性脂肪酶产生菌的筛选模型，并选育出适用于饲料用的酸性脂肪酶菌株FL002。大量研究表明，微生物脂肪酶对动物体内源消化酶的分泌有一定的促进作用，并有利于营养物质的消化与吸收。Tan等（2000）研究表明，在含全脂米糠、高油玉米、血粉等的饲料中添加脂肪酶，可提高饲料表观消化率5%～11%，提高猪、禽增重速度4%～10%，提高饲料利用率2%～7%，并能减少粪便排泄量。何前等（2010）在黄羽肉鸡饲料添加脂肪酶，能显著提高饲料中粗脂肪的表观利用率。但由于脂肪酶的结构和性质的多样性，酶的不稳定性，底物的不溶性和纯化困难，使其研究进展相对较慢。单胃动物能够分泌脂肪酶，但幼龄动物内源性脂肪酶的分泌量明显不足。张振斌和蒋宗勇（1999）对14日龄仔猪断奶后脂肪酶活性变化的研究表明，断奶后胰脂肪酶活性不断下降。Freeman（1976）研究报道，肉鸡出壳时对动物脂肪的利用率很差，随日龄的增加活性逐渐增加。在饲料中添加外源脂肪酶能够补充动物特殊生理阶段内源脂肪酶的不足，提高脂肪的消化，微生物脂肪酶可提高断奶仔猪等幼龄动物的生产性能、缓解应激、促进动物生长。王海燕等（2007）研究发现，在幼禽、幼畜日粮中添加外源性淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，能够补充动物体内内源酶的不足，并能减轻断奶仔猪的断奶应激，提高生产性能。时本利等 （2010）在断奶仔猪常规豆粕-玉米型日粮中添加微生物脂肪酶，结果表明，添加脂肪酶可显著提高仔猪日增重，降低料重比及腹泻率。

6 小结

综上可见，微生物脂肪酶在饲料中具有广阔的应用前景。许多国家规定了禁止在饲料中添加使用某些抗生素作为促生长剂，迫使饲料生产企业寻找替代品，加酶成为首选，随着酶和底物以及肠道环境之间作用机理研究的不断深入，酶技术的应用前景也变得越来越宽广，推动了饲用酶的发展。

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