HPLC法测定4种益母草制剂中盐酸水苏碱及其标准方法评价

包小红，周娟，伍丕娥

(四川省食品药品检验所，四川成都610097)

益母草为唇形科益母草属植物Leonurus japonicusHoutt.的地上部分，原名茺蔚，据文献［1-2］可知，其主要化学成分为生物碱类(盐酸水苏碱、益母草碱、益母草定、益母草宁等)、黄酮类、二萜类、甾醇、有机酸、多种微量元素及脂肪。其中盐酸水苏碱是主要的活性成分之一，具有活血调经，利尿消肿，收缩子宫的作用，该成分的定量测定方法在《中国药典》2010年版一部“益母草”项下已有收载［3］。

益母草制剂涉及的现行标准见表1［4-6］。针对标准的现状，参照文献［7-8］，对4种益母草制剂中的盐酸水苏碱的定量测定方法进行了研究和统一。

表1 益母草制剂的现行标准

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters2695高效液相色谱仪-Waters2487紫外检测器(美国Waters公司)，Empower工作站;Agilent1200高效液相色谱仪-AgilentDAD检测器(美国安捷伦公司)，Chem-Station工作站;Agilent1200高效液相色谱仪-Alltech ELSD2000检测器，Chem-Station工作站。

1.2 试药甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。盐酸水苏碱对照品为中国药品生物制品检定所提供(批号110712-200709，含量测定用，含量以99.0%计，使用前于五氧化二磷减压干燥12 h以上)。

2 溶液制备

2.1 对照品溶液取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加入甲醇制备成质量浓度为0.960 8 mg/mL的溶液，作为对照品贮备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由贮备液稀释得到。

2.2 供试品溶液取益母草颗粒粉末约1 g(或益母草片粉末0.5 g，益母草胶囊内容物0.5 g，益母草膏1 g)，精密称定，置150 mL具塞锥形瓶中，精密加入0.5%盐酸甲醇25 mL，称质量，超声30 min，放冷，用0.5%盐酸甲醇溶液补足减失的质量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。或取益母草软胶囊内容物适量，混匀，取约2 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，置水浴中微热，充分振摇，放冷，滤纸滤过，续滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

3 色谱条件

采用Agilent SCX300阳离子交换(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾-磷酸(15∶85∶0.15)为流动相;检测波长192 nm;柱温30℃。在上述色谱条件下各色谱峰分离良好，辅料空白无干扰。见图1。

图1 HPLC色谱图

4 方法学考察

4.1 线性关系及定量限考察分别精密量取上述一系列质量浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积，并以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，进行回归，得回归方程:Y=279 635.8X+37 818.6r=0.999 7。结果表明:盐酸水苏碱在0.238～19.04 μg范围内进样具有良好的线性关系。由于本次样品的水苏碱含量差异大，有些极低，因此我们确定了一个定量限:精密量取盐酸水苏碱对照品(1.38 μg/mL)20 μL，按选定方法测定，结果S/N≈10，因此本品定量限为27.6 ng。

4.2 精密度试验精密吸取对照品溶液(0.430 5 mg/mL)5 μL，按上述色谱条件中方法测定，连续进样5次，峰面积RSD为0.19%。

4.3 稳定性试验取已配制好的盐酸水苏碱对照品溶液(0.402 2mg/mL)5 μL和供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下，分别于0、4、8、16 h进样，记录峰面积，结果各溶液峰面积的RSD分别为1.75%(对照品)、1.66%(益母草颗粒)、1.66%(益母草膏)、1.42%(益母草片)、0.98%(益母草胶囊)。

4.4 耐用性试验取各剂型的同一批样品，分别采用不同的HPLC色谱仪和SCX色谱柱进行测定，结果见表2。

表2 不同色谱仪和色谱柱的考察结果

4.5 重复性试验取各剂型同一批号样品，按上述溶液制备项下的方法制备供试品溶液，各制备6份，按上述色谱条件测定，结果样品中含盐酸水苏碱量分别为5.051 mg/g、RSD为0.73%(益母草颗粒)，3.913 mg/g、RSD为1.39%(益母草膏)，15.647 mg/g、RSD为0.69%(益母草片)，23.784 mg/g、RSD为0.61%(益母草胶囊)。

4.6 加样回收试验精密量取盐酸水苏碱对照品溶液(1.205 mg/mL)1.3、1、2、3 mL，各6份，分别置150 mL具塞锥形瓶中，水浴上挥干甲醇。分别取已知含有量的益母草颗粒细粉(质量分数为5.051 mg/g)0.5 g，益母草膏(质量分数为3.913 mg/g)0.5 g，益母草片细粉(质量分数为15.647 mg/g)0.25 g，益母草胶囊细粉(质量分数为23.784 mg/g)0.25 g，各6份，精密称定，置上述具塞三角瓶中，精密加0.5%盐酸甲醇25 mL，称定质量分数量，其余照供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定，记录色谱图，并按下列公式计算回收率，结果回收率分别为99.0%、RSD为0.98%(益母草颗粒)，98.1%、RSD为2.00%(益母草膏)，99.5%、RSD为1.79%(益母草片)，102.0%、RSD为0.79%(益母草胶囊)。

4.7 样品测定依据建立的盐酸水苏碱定量测定方法，对212批益母草颗粒、60批益母草膏、14批益母草片、12批益母草胶囊及8批益母草软胶囊进行了考察。结果益母草颗粒含盐酸水苏碱量在0.04 mg/g～10.94 mg/g之间，益母草膏含盐酸水苏碱量在2.8 mg/g～11.2 mg/g(标准规定为不得少于3.6 mg/g)之间，益母草片含盐酸水苏碱量在8.4 mg/g～13.9 mg/g之间，益母草胶囊含盐酸水苏碱量在13.8 mg/g～23.1 mg/g之间，益母草软胶囊含盐酸水苏碱量在7.5 mg/粒～9.6 mg/粒之间，其中益母草颗粒中盐酸水苏碱的含有量差异极大。

5 讨论

5.1 曾参照《中国药典》2010年版一部“益母草”含量测定项下盐酸水苏碱的检测方法，采用丙酰胺基柱，蒸发光检测器测定，测定条件为流动相乙腈-水(80∶20);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;空气体积流量2.0 L/min;漂移管温度80℃，对益母草颗粒和益母草片的水苏碱含有量进行了重复性考察，结果分离度高，重复性良好，且两种方法所测定的含有量结果(采用相同的供试品溶液进行比较)相近。但是，由于采用蒸发光检测器时计算较复杂，且该仪器的普及率较紫外低，因此我们最终选定了紫外检测器作为检测方式。

5.2 提取溶剂分别考察了无水乙醇、70%乙醇、0.5%盐酸乙醇、0.5%盐酸甲醇、1%盐酸甲醇和甲醇，结果溶剂为0.5%盐酸甲醇时，水苏碱的提取效率最高。

5.3 益母草颗粒现行标准(本次试验涉及的样品执行的标准为部标［6］，现已收载入《中国药典》2010年版一部，增加了水苏碱的薄层鉴别及含测项目)中检测项目严重缺失，除了常规检查项，就只有一个生物碱的化学鉴别反应，专属性差，控制水平低，因此产品质量混乱，含有量差异极大，而其它剂型因标准中均对水苏碱含有量或生物碱含有量作出了控制，产品质量情况相对较好。结果表明标准的完善和有效性对药品质量的控制有着重要的作用。

5.4 益母草片、胶囊现行标准中的定量测定方法均采用的是雷氏盐沉淀，以重量法或紫外分光光度法测定其总生物碱的含有量，专属性差。益母草膏现行标准中的水苏碱定量测定采用的是薄层扫描法，该法在操作过程所受影响因素较多，可操作性较差，薄层板展开时，展开剂的比例和展开环境(温湿度)，薄层板固定相的厚度和紧密度，显色时所喷显色剂的量和在薄层板上的均匀度，均要影响最终的测定结果，该法重复性较差，容易造成结果的误差，难以正确把握产品的含有量，本实验采用了HPLC法测定水苏碱，前处理简单，方法统一，结果准确，重复性好，测定结果可以有效地反应不同剂型或同一剂型样品之间的质量差异。

5.5 益母草软胶囊本次样品涉及3个标准(国家药品标准YBZ29422005-2010Z，国家药品标准YBZ00722009及批件2009B00079，国家药品标准YBZ29422005-2010Z)，其中定量测定方法各不相同(见表1)。从标准中看，含药材量(每粒)最高的样品其规定的含测限度反而较低，按照标准测定该样品，其测定结果也较别家样品低，仔细分析原因后发现，该标准样品前处理方法较复杂，可操作性及重复性较差，可能导致其测定结果偏低。按照统一的定量测定方法对上述3个标准的样品进行考察，结果样品含有量的高低与其每粒所含药材量的高低完全一致.因此，检验方法不合理，则检验结果难以真实反应产品的质量;方法不一样，则检验结果相互之间也缺乏可比性。

［1］南京中医药大学.中药大辞典下册［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:2695.

［2］国家中医药管理局.中华本草精选本下册［M］.上海:上海科学技术出版社，1998:1601.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:272.

［4］国家药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂第13册［S］.1997:175.

［5］国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准21分册［S］.2002:521.

［6］国家药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂第7册［S］.1993:141.

［7］严优芍，李卫民.HPLC法测定益母草分散片中盐酸水苏碱的含量［J］.广东药学院学报，2006，22(6):604-606.

［8］张韵，黄瑞红.HPLC法测定安坤益母草片中盐酸水苏碱的含量［J］.广东药学院学报，2008，24(1):20-21.