原代培养小鼠睾丸间质细胞的甘草毒性研究

孙新明，杨亚军

(井冈山大学医学院，江西吉安343000)

不孕不育症是全球性复杂的医学和社会学问题之一。随着工业的日益发达及对环境污染控制的相对不足和临床药物滥用，男性因素所引发的不育不孕症发生率越来越高而逐渐引起人们的重视［1-3］;长期以来，甘草等植物中草药及其复方常作为中药材食品添加物及临床常用药得以广泛应用。但近代药理研究发现，不少临床常用的中药如甘草、补骨脂等可促进雌性动物乳腺发育和子宫明显增质量及血清雌激素水平升高［4］，但其雌激素样作用是否与环境雌激素一样具有男性生殖毒性作用?特别是甘草对男性生殖系统的毒性作用目前尚未见细胞毒性研究。鉴于此，本研究从甘草对雄性小鼠睾丸间质细胞体外培养及其分泌睾酮的影响入手研究甘草对睾丸的生殖毒性，为甘草等具有雌激素样作用中药材的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料清洁级BABL/c雄鼠10只(购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司);市售药用甘草采用超声提取法和树脂吸附技术自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/mL)后用PBS溶液配制成10 mg/mL药物浓度，过滤除菌，置冰箱冷藏备用;

1.2 主要试剂DMEM、DMEM/F12、小牛血清、苔盼蓝购于GIBCO公司;胶原酶、透明质酸酶、perooll分离液、Hepes购于SIGMA公司;胰蛋白酶购于AMRESCO公司;HE染色液、PBS、D-hanks液培养基均为自制试剂;其他常规普通试剂均为国产分析纯。

1.3 甘草对睾丸间质细胞的体外毒性实验

1.3.1 小鼠睾丸间质细胞的分离与培养取4～5周龄22～25 g的BABL/c雄鼠10只，按照邵冰玉等报道的方法［5］分离得到睾丸间质细胞悬液。调整细胞密度(3～5×105个/mL)接种于24孔培养板，在10%小牛血清的DMEM培养基中于培养箱(37℃、5%CO2、饱和湿度)中进行培养，每24 h换液。

1.3.2 小鼠睾丸间质细胞体外药物毒性实验培养贴壁(记为0)后进行以下分组实验:一组为不给药对照组，另一组为给药实验组。对实验组先用MTT法［6］确定甘草提取物对睾丸间质细胞体外毒性的IC50值和最低毒性剂量，以细胞存活率为80%±的药物浓度为细胞最低毒性剂量;细胞存活率%=(加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD－本地OD)×100%(本底OD值为酶标仪在570 nm波长处检测无细胞的完全培养基加MTT的光密度值);以IC50值和最低毒性剂量作为高、低两个剂量药物浓度，加入0.5 mL药液于培养的0.5 mL细胞培养液中继续进行培养。在细胞继续培养的0、12、24 h、48 h对各组培养贴壁细胞进行H-E染色后光镜观察。

1.3.3 睾丸间质细胞培养液中睾酮水平的测定用酶联免疫吸附法，按照试剂盒使用说明测定1.3.2项中各试验组在细胞继续培养的0、12、24、48 h时培养液中睾酮水平。

2 结果

2.1 睾丸间质细胞体外毒性实验结果

2.1.1 MTT法测定甘草提取物对睾丸间质细胞的毒性结果

结果见表1。

表1 MTT法测定甘草提取物对睾丸间质细胞的毒性结果

MTT法测定结果显示，甘草提取物对睾丸间质细胞的体外毒性IC50=275 μg/mL，最低毒性剂量为10 μg/mL，即给药组的高、低剂量质量浓度分别为275 μg/mL和10 μg/mL。

2.1.2 甘草提取物对间质细胞体外培养结果对分离到的睾丸间质细胞培养6 h后细胞开始发生极化，偶有贴壁。培养48 h后(0 h)多数细胞贴壁，对进一步培养的各组细胞进行H-E染色后镜检发现，刚贴壁的细胞形态呈梭形或不规则三角形，细胞间以其突起形成网络状连接，轮廓不清(见图1)。随着培养时间延长，在对照组细胞轮廓成为多角形或不规则形状，有3～4个突起伸出，至进一步培养48 h后间质细胞呈多边形或长梭形，贴壁细胞数量逐渐增多而变得越来越密集，但细胞界限越清晰，细胞间有空隙且排列无极性(图2C～4C);在给药实验组，则随着体外培养时间的延长，细胞的生长状态变差，贴壁细胞形态变化与对照组相同，但与对照组形成鲜明对比的是，细胞的密度变得越来越稀疏，表明细胞生长分裂受到抑制，有些贴壁细胞发生凋亡，在给药培养48 h显得尤为明显，这种变化在高浓度给药实验组比低浓度给药实验组更为突出(见图2～4)。

图1 培养48 h贴壁的睾丸间质细胞，H-E×200

图2 对照组培养贴壁的睾丸间质细胞继续培养12 h(2C)、24 h(3C)和48 h(4C)后细胞形态学观察，H-E×200

图3 高浓度给药组培养贴壁的睾丸间质细胞继续培养12 h(2H)、24 h(3H)和48 h(4H)后细胞形态学观察，H-E×200

图4 低浓度给药组培养贴壁的睾丸间质细胞继续培养12 h(2L)、24 h(3L)和48 h(4L)后细胞形态学观察，H-E×200

2.1.3 培养液中睾酮水平检测结果用酶联免疫吸附试剂盒测定培养液中睾酮水平，结果见图5。统计结果显示，贴壁细胞继续培养12 h、24 h及48 h后培养液中睾酮水平，在对照组、低剂量组和高剂量组间两两比较差异均极为显著(P＜0.01)。

图5 在各药物浓度下培养间质细胞时培养液中睾酮水平

3 讨论

关于植物雌激素对雄性动物的影响有较多研究报道认为，给雄性动物喂饲含异黄酮类雌激素的植物可促进睾丸增重和血清睾酮含量，并促进睾丸曲细精管明显增大，初级精母细胞形成提前，即具有促进雄性动物生殖系统发育的作用［7］，因而表现出与环境雌激素对雄性个体完全不一样的作用［8］。但植物雌激素对睾丸细胞体外培养的影响和中草药雌激素样作用对睾丸毒性的研究报道并不多。朱锋荣等［9］的研究认为，植物雌激素(染料木素)在低浓度下(0.1 μmol/L)给药时可显著促进睾丸间质细胞分泌睾酮，但当植物雌激素浓度大于5 μmol/L时，却显著抑制间质细胞的睾酮分泌。有研究认为，苦参可使精子瞬间失活的最低有效质量浓度为0.85～3.15 g/L，形态学观察发现苦参碱对精子有致死作用，而芦荟对雄性鼠性腺、精液有一定的影响，使雌性小鼠的妊娠率降低，畸胎率升高［10］。

甘草具有补脾益气、清热解毒、缓急、止痛等功效。常用于脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸短、咳嗽痰多、脘胀、四肢挛急、疼痛、痈肿疮、缓解药物毒性等。中医界自古有“十方九草”之说［11］。因此，甘草常作为中药材食品添加物及临床常用药物得以广泛应用，其主要化学成分是甘草甜素、甘草次酸。中药药理学认为，大剂量的甘草甜素有雌激素样作用，而甘草次酸具有抑制雄性小鼠生殖腺产生睾酮的作用［12］，但其是否与其他含异黄酮类雌激素的植物对男性生殖系统具有类似的作用?目前未见详细研究报道。

睾丸间质细胞也称为Leydig细胞，是合成和分泌雄激素(睾酮)的主要场所，其分泌的雄激素可结合支持细胞分泌的雄激素结合蛋白而维持生精小管内较高的雄激素浓度，以促进生精小管内各级生精细胞的增殖、发育，因此睾丸间质细胞与支持细胞和生殖细胞之间关系密切，其生存状态及分泌睾酮的功能活动可在很大程度上影响、甚或体现睾丸的生殖活动［13］。因此，睾丸间质细胞也通常作为研究药物对睾丸分泌睾酮作用的体外模型［14］。但睾丸间质细胞的分离纯化一直是国际上进行深入研究的瓶颈。本研究应用邵冰玉等［5］的方法分离纯化小鼠睾丸间质细胞，因为他们应用17-α羟化酶mRNA扩增表明培养的间质细胞具有较高纯度。此外，本研究中对分离到的间质细胞进一步培养后HE染色镜检，形态变化与刘玉志等［15］报道的相同，因此在本实验中未对相同方法分离培养的间质细胞进行进一步鉴定。另外，本研究选用4～5周龄成年小鼠，此时睾丸中间质细胞的数量和分泌能力均达到高峰［16］，便于研究药物对间质细胞分泌睾酮的影响。本研究结果显示，超过10 μg/mL甘草提取物浓度对体外原代培养小鼠睾丸间质细胞的生长和睾酮分泌均具有显著抑制作用，且随药物浓度增加和培养时间延长，抑制作用越加明显。需要提及的是，本研究用的自制甘草浸膏所含的甘草提取物中除了具有对雄性生殖细胞具有影响的甘草甜素、甘草次酸等药效成分外，还含有多种非疗效成分。本研究采用超声提取法和树脂吸附技术将药用甘草自制成浸膏，浸膏中无甘草成分以外的其他对细胞有害的成分，也没有将甘草中的其他非疗效成分去除，结果虽然不能完全反应仅为甘草中甘草甜素或甘草次酸对雄性的毒性作用，这是本研究存在的一个缺陷。但我们认为，这样制成的甘草浸膏更能反应甘草对男性生殖的毒性。欲知非疗效成分对睾丸间质细胞的毒性，可能还需进一步分离甘草中非疗效化合物对睾丸细胞毒性进行追踪研究。但可以肯定的是，在进行细胞体外研究时，甘草浸膏的最低毒性剂量仅为10 μg/mL，而甘草中主要化学成分是甘草甜素和甘草次酸，故其受试物中疗效成分的含有量已较低，非疗效成分含有量更低，因而也不会对雄性生殖细胞产生很大的毒性。

然而，仅凭在细胞培养系统中添加药物所表现出的对睾丸间质细胞和生精细胞的生长抑制作用很难断定该药物对在体睾丸具有生殖毒性作用，要确切了解甘草对睾丸的生殖毒性作用，需要进一步研究甘草对在体睾丸的毒性作用。

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