猪瘟防控技术研究进展

王 琴，范学政，赵启祖，徐 璐

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

猪瘟又称经典猪瘟(Classical swine fever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病，是严重危害全球养猪业的重要传染病。近10年来，中国兽医药品监察所在猪瘟的流行病学、信息系统的建立、诊断系列新技术研发、疫苗效检替代方法、致病机制及标记疫苗的研究以及猪瘟的防控与净化方面所取得了突破性进展，现综述如下。

1 我国猪瘟病毒分子流行病学及信息系统的研究

CSF分子流行病学调查研究对阐明CSFV的遗传变异特征和规律，掌握当前的流行现状，溯源和追踪CSF疫情发生的来源和去向，监测现行使用疫苗的有效性，建立分子流行病学监测系统，提出新的防制策略具有十分重要的科学意义。

国际上将CSFV分为3个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群)，10 个基因亚群(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和 3.4)［1］。为弄清我国 CSF 流行病学本底，中国兽医药品监察所和军事兽医研究所分析了我国31个省市自治区自1979到2010年间的554条E2基因序列，表明我国流行毒株均为4个基因亚群(2.1、2.2、2.3 和1.1)，以基因 2 群(73.82%)为主，其次是 1 群(26.18%)。一直没有监测到基因3群的传入与流行，但在周边国家和地区如韩国、泰国、台湾等均有基因3群，应严密加强监测［2］。多年一些学者认为流行毒株免疫基因正在朝着远离疫苗的方向变异，导致免疫失败，对上述从1979-2010年流行毒株与疫苗株E2基因核苷酸同源性进行逐年分析，发现疫苗毒株抗原基因与流行株同源性在2007年最低，为76.2%，疫苗免疫保护试验也证实了我国目前使用的疫苗对同源性在76.2%以上的流行毒株攻击依然有效［3］。中监所曾用不同时间、不同地点、不同基因亚群和不同致病力的野毒株进行单独、混合、一次、多次或交叉攻毒，结果接种猪均能得到完全保护［4］。为此在我国使用HCLV进行高密度(100%)强制免疫，仍然是有效的政策，笔者建议在今后的监测工作中，如发现流行毒株与疫苗株E2基因同源性低于76.2%时，应及时进行免疫保护实验并监测疫苗的有效性。国际上对CSFV的分子流行病学研究，以位于德国汉诺威(Hannover)的欧盟CSF参考实验室研究数据最为完善，该实验室收集了来自35个国家E2基因数据已经接近1000条。我国经过多年的CSFV分子流行病学调查研究，弄清了中国CSFV的遗传衍化背景，填补了国际上CSFV分子流行病学研究缺乏中国数据这一空白，表明我国CSFV遗传变异情况在32年间处于稳定状态。通过调用欧盟CSF参考实验室的部分基因数据，有助于分析我国猪瘟流行病学数据，为防治提供依据。我国养猪模式多样，生态环境多样，继续开展不间断的分子流行病学跟踪调查，实时跟踪病毒变异特征及抗原性变异程度，监测新的流行毒株的情况和疫苗对流行毒株的有效性，不仅对我国CSF防制具有重要的指导意义，对建立该病毒的全球监测体系具有深远意义。

中国兽医药品监察所联合军事兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心将CSF流行病学信息数据与数据库技术、GIS技术、生物信息学技术相结合。采用ArcGIS桌面产品、ArcMapObjects软件和Delphi软件，在中国数字地图的数据支持下，创新性的建立了CSF流行病学信息系统(CSFinfo)，使我们成为全球继德国之后第二个有这种数据库的国家［5］。CSFinfo对加强CSF流行病学信息的统一管理，掌握全球CSF数据，分析CSF传播来源，建立一整套连续、可靠、完整、系统的国内外CSF流行病学资料，对我国CSF防控具有十分重要的意义。

2 猪瘟病毒致病机制

CSFV的3’UTR被认为与病毒基因组的复制、翻译以及复制和翻译的调控有关，序列比对发现HCLV的3’UTR核苷酸的第61位有一个12-nt(CUUUUUUCUUUU)的插入序列，而在强毒SM株以及其它毒株中缺失。为研究这一特征性序列的生物学功能，构建两个突变株感染性cDNA克隆，一株是在强毒SM株基因组pT7SM感染性cDNA克隆 3’UTR的第 61位处插入了 12个碱基“CTTTTTTCTTTT”;另一个是 pT7SM 的3’UTR完全被HCLV基因组3’UTR所替换。结果两个突变株在PK-15细胞上的增殖滴度比其亲本株下降了约100倍，对实验用猪产生了明显减毒的现象，有效诱导宿主产生中和抗体并使宿主完全抵抗致死剂量SM强毒的攻击，与HCLV十分类似。表明HCLV 3’UTR的12个碱基插入对CSFV复制和毒力有着重要影响，与疫苗减毒有重要关系。该结果也提示CSFV的非编码区突变可以影响病毒的毒力，这对理解CSFV的减毒机理以及开发新一代疫苗提供理论依据［6］。

3 猪瘟诊断新技术

CSF的诊断多年来一直困扰着对该病的净化策略，近年我国CSF诊断技术取得突破性进展。病原分子诊断技术已经达到国际水平，同时建立了抗体阻断ELISA方法和抗体间接ELISA方法。

3.1 病原学诊断技术 中国兽医药品监察所和军事兽医研究所CSFV通用荧光RT-PCR试剂盒的建立，可对所有CSFV进行检测，该方法十分成熟和稳定，获国家专利(200610109404.X)并形成国标(GB/T27540-2011)，特别对非典型、温和型及持续感染CSF的诊断提供一个快速、敏感、准确的方法，是适用于种猪净化的可靠手段。我国CSF免疫采取的是100%强制免疫措施，建立快速、敏感、特异地检测CSFV野毒的方法十分必要，CSFV MGB鉴别荧光RT-PCR方法的研制，为临床鉴别野毒和疫苗毒提供了可靠的工具，该方法获国家专利(CN2010242080.0)。欧盟CSF参考试验室根据已知毒株的基因序列，锁定主要保护性抗原E2基因区域的2467～2738之间共272bp的片段作为序列测定和分析目标，能反应不同毒株抗原基因序列的变化特点，是用于毒株间系统发生分析的首选公认区域［1］。本课题组对其改进优化，并进行了12年的临床应用，该方法不仅可用于核酸的检测和诊断，采用其扩增产物直接测序用于CSFV分子流行病学研究，达到了一举两得的目的［7］。

CSFV抗体标记技术有免疫荧光技术和过氧化物酶标记技术，也是OIE推荐的CSF病原检测技术之一。采用从英国AHVLA实验室引进的CSFV E2单抗WH303作为一抗，标记辣根过氧化酶的兔抗鼠二抗，建立了免疫过氧化物酶细胞单层试验染色方法，用于CSFV TCID50检测、疫苗定量、病毒分离鉴定、拯救重组CSFV的鉴定［8-9］，具有很好的特异性和准确性。直接对单抗WH303进行荧光素标记，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应蛋白抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。我所和军事兽医研究所采用该单抗(WH303)分别建立了CSFV免疫荧光试验和CSFV间接免疫荧光试验，较多抗标记法更特异和准确，容易分辨，错判误判率会大大减少，田间推广应用容易，是CSF净化的一项准确、特异和简便的技术。

3.2 抗体检测技术 CSF抗体水平检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，ELISA方法以其操作简便、敏感、检测样本量大等优点成为其主要手段，研发国产化的准确度高的CSF抗体ELISA检测试剂盒势在必行。本实验室采用杆状病毒表达系统获得CSFVE2基因可溶性表达产物(CN200810223406.0)，突破了诊断用抗原的关键制备技术;对单抗WH303进行纯化和FITC标记，分别建立了 CSF间接ELISA方法和阻断ELISA方法［10］。

抗体间接ELISA方法:采用中和实验作为金标准与间接ELISA对232个阳性样本和242个阴性样本进行符合实验，其敏感性符合率为90.95% ，特异性符合率为94.21%，两种方法的总符合率为92.62%。该方法具有操作简便，灵敏度高等特点，通过对血清中E2蛋白多抗的检测，可全面反应猪体内抗体水平，适用于田间大规模免疫抗体水平普查、商品猪场免疫效果评价和不同免疫水平猪群的分群。

抗体阻断ELISA检测方法，对PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗体(CSF抗体为阴性)无交叉反应。对285份临床血清样本的检测结果表明，与IDEXX试剂盒的特异性为94.2%，敏感性为98%，两种方法的符合性为97.5%。由于采用单抗WH303作为酶标抗体，大大了降低非特异性反应。该方法除用于田间大规模普查外，尤其适用于规模化种猪场和重点疫区抗体监测。制备成本较低，稳定性好，为我国CSF抗体水平的监测提供了重要的技术支持。

3.3 猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法的建立 猪瘟兔化弱毒株是世界公认的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我国唯一使用的猪瘟疫苗毒株。由于家兔个体差异和标准化程度不高、检测周期长有关，无疑提高了疫苗储藏成本，因此家兔热反应对疫苗效力检验结果不准确，建立新的准确简便的替代方法，提高疫苗检测质量，对其质量监控至关重要。我们建立的HCLV荧光定量PCR方法和单抗WH303直接免疫荧光检测方法与兔热反应比较，三者之间存在良好相关性，对CT值在17.10～20.81，病毒含量在8.27 ×104～1.11 ×106copy/μL，TCID50值在 10-2.88/0.1 ～10-4.54/0.1 mL 之间的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100万个兔体定型热反应进行配苗［11］。为疫苗效检提供了一种快速、敏感、特异的方法，代替传统的兔热反应方法，更准确、快速指导疫苗的生产，缩短生产周期，产生更明显的经济和社会效益。

应欧盟CSF参考实验室邀请，中监所从2009到2011年连续3年参加欧盟CSF参考实验室组织的来自42个国家50个实验室的CSF诊断比对实验。采用了本实验室建立的CSFV通用荧光RT-PCR方法、CSFV鉴别荧光MGB-RT-PCR方法和CSFV RT-nPCR方法，病原检测结果与欧盟完全一致;采用本实验室建立的CSF抗体间接ELISA和阻断ELISA方法，仅间接ELISA对一个盲样反应结果为阴性或可疑，其余样本完全符合。3次国际比对、国内比对以及我们的大量实验结果显示，中监所研制的系列方法弥补了我国CSF病原检测的空白，组装的CSF病原检测试剂盒相关指标达到欧盟参考实验室技术标准，抗体检测试剂盒相关指标达到了进口商品化试剂盒的标准。可实现CSF病原检测和CSF抗体检测试剂盒的国产化，提升我国CSF诊断水平，为获得国际贸易认可铺平了道路，具有很好的推广应用前景和极大的产业化价值。

通过和欧洲的交流及合作，提升了科技创新能力，解决CSF准确诊断的关键问题，建立了良好的国际合作渠道，提升了该实验室的国际地位，建立并完善我国系列CSF诊断技术，进而改进和完善我国CSF预防控制策略。至此，我们在CSF诊断、疫情监测、分子流行病学调查分析等所需的检测方法已经系统建立，已经成为国内建立和掌握CSF诊断技术最全的实验室之一。

4 标记疫苗的研究

由于HCLV接种猪与自然感染猪不能从血清学上予以区分，我国CSF防控实行的是强制免疫措施，开发CSF标记活疫苗对于我国CSF净化和参与国际贸易具有现实意义。本实验室运用反向遗传操作技术，在C株感染性克隆的E1 C末端插入FLAG基因作为标记分子，构建了含有FLAG标记的vC-FLAG病毒。细胞适应性实验证明vC-FLAG病毒可以适应多种猪源细胞，SK6细胞系是培养vC-FLAG的最适细胞系。不同代次病毒经免疫组化、RT-PCR和核苷酸序列测定证明嵌合病毒能稳定表达标记抗原，且在细胞中传代的遗传稳定性良好，为CSF标记疫苗研究奠定了基础。

5 猪瘟净化策略研究

CSF是我国政府计划要根除的重要传染病，通过“十一五”支撑计划《猪瘟、猪伪狂犬病综合防空集成与示范》的实施，集成上述技术，按照准备阶段→控制阶段→强制净化阶段→监测阶段→认证阶段等五个净化程序，通过对CSF快速诊断试剂盒、疫苗毒株和致病毒株鉴别诊断方法的筛选和整合，免疫程序的调整，生物安全措施的综合实施。对CSF严重污染场，CSF病原阳性率分别从2006年的7.08% ～11.49%下降至 2010年的0% ～2.07%，达到基本清除CSF的目标;对CSF一般污染场，阳性率分别从0.87% ～3.09%下降至0%，清除CSF。CSF免疫合格率总体上升，从2006年的67.30% ～90.67%上升至2010年的 85.00% ～96.32%。达到了基本无疫或无疫，成功在15个规模化养猪示范场使7个场净化了CSF，示范场生产指标得到了全面改善，经济效益稳步提升，提升了养猪场的理论水平和疫病防控能力。构建了符合我国国情的规模化猪场CSF和猪伪狂犬病的不同净化模式，形成了一系列的指导方案，制定了《规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病综合防控技术集成与示范实施方案》、《规模化猪场猪瘟净化技术指南》、《集约化、规模化猪场生物安全体系的实施方案》和《“猪瘟、猪伪狂犬病综合防控技术集成与示范”课题种猪净化认证方案建议》等指南，取得的重要创新性成果，可用于指导我国CSF的防控和净化。

CSF困扰我国养猪业已经半个多世纪，目前依然是各级政府计划要根除的重大猪病。上述研究表明CSF的病毒基因组比较稳定，且只有一个血清型，对该病毒的清除是一个有利条件。同时本实验室研发的诊断技术已经达到国际技术标准，并被国际上认可。尤其是“十一五”期间对我国部分养猪场净化CSF的成功先例表明，在我国目前猪病流行状态下，在规模化猪场和部分区域开展CSF的净化是完全可行的。

致 谢: 感谢军事兽医研究所涂长春教授，中国动物与卫生流行病学中心黄保续教授及英国AHVLA Trevor Drew教授给予的帮助。

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