藏药三味檀香汤散对全脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区神经元DND和凋亡的影响

刘杰，刘辉琦，王生兰，曹学锋，吴穹

(青海大学医学院，青海西宁810001)

三味檀香汤散藏药名:赞旦松汤，由檀香100 g、肉豆蔻100 g、广枣100 g经过粉碎、混合制成的棕红色散剂，方中檀香为君药，辅以肉豆蔻和广枣，具有清热、祛风、养心之功效，是蒙藏医治疗心热病的常用药方［1］。目前应用三味檀香汤散在心血管缺血缺氧方面有一些研究［2-7］，认为此方剂对急性缺血缺氧、心肌缺血/再灌注损伤引起的心肌细胞损伤具有一定的保护作用［4］，但对脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，I/R)研究的报道甚少。本实验通过四血管闭塞法复制大鼠全脑缺血/再灌注损伤模型，全脑缺血/再灌注损伤前藏药低、高剂量组分别用三味檀香汤散低、高剂量给大鼠灌胃预处理，标本硫堇染色下观察海马CAl区神经元组织学分级(Histological grade，HG)、神经元密度(neuronal density，ND)的变化，反映神经元迟发性死亡(Delayed Neuron Death DND)的情况;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测神经细胞凋亡阳性个数和免疫组织化学法检测caspase-3表达的变化，反映神经元凋亡的程度，为探讨三味檀香汤散对全脑缺血/再灌注损伤大鼠海马CAl区神经元的保护作用提供实验依据。现将有关情况报告如下。

1 材料

1.1 动物兰州大学医学院实验动物中心提供雄性Wistar大鼠［SCXK(甘)2009-0004］，清洁级，48只，在我院实验室饲养2～3周，体质量至280～320 g开始实验。

1.2 药物与试剂藏药三味檀香汤散(青海省金诃藏药厂生产，标准编号:WS3-BC-0260-95)，每袋装40 g，用前研磨成粉，用蒸馏水配制成50%的水溶液(每毫升溶液含生药0.5 g)［4］;硫堇(分析纯)购于美国Sigma公司，TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒购于北京中昊时代生物公司，caspase-3免疫组化染色试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。

2 方法

2.1 大鼠全脑缺血/再灌注损伤模型的制备采用Pulsinelli四血管闭塞法建立全脑缺血模型。所有实验动物首先凝闭双侧椎动脉，方法如下:动物全麻、固定，后颈部纵行切口，钝性分离暴露双侧翼状孔，彻底电凝双侧椎动脉，术毕单笼饲养48 h后复制动物全脑缺血/再灌注损伤模型:乙醚吸入麻醉、夹闭双侧颈总动脉持续8 min，首先可见大鼠濒死挣扎，后翻正反射消失，双瞳孔散大、对光反射消失，部分动物出现呼吸暂停，缺血8 min后迅速解除颈总动脉夹闭，大鼠双眼瞳孔逐渐恢复至正常，对光反射、翻正反射恢复，完成脑缺血/再灌注损伤模型复制，术毕将动物单笼独饲养(按标记检测HG、ND的大鼠饲养7 d，检测TUNEL和caspase-3的大鼠饲养3 d)。

2.2 动物分组与给药方法48只大鼠随机分为4组(每组12只:6只用于硫堇染色观察HG和ND，6只用于检测TUNEL和caspase-3阳性细胞数):①假手术组:凝闭双侧椎动脉，暴露但不夹闭双侧颈总动脉;②全脑缺血/再灌注损伤模型组:凝闭双侧椎动脉，夹闭双侧颈总动脉8 min;③三味檀香汤散低剂量预处理组(藏药低剂量组):在全脑缺血前10 d起三味檀香汤散按成人剂量的10倍，即1.0 g/kg，每天灌胃1次，连续10 d，余同I/R模型组;④三味檀香汤散高剂量预处理组(藏药高剂量组):藏药按成人剂量的15倍，即1.5 g/kg给药，余同藏药低剂量组。

2.3 指标测定及方法按动物分组标记造模规定时间断头处死动物，冰皿上快速取脑，在自嗅结节前缘4 mm处做成厚约4 mm包含双侧海马组织的冠状切面的脑片，放入4%多聚甲醛液中固定48 h，脱水，浸蜡，包埋后连续5 μm切片。①硫堇染色，按Kitagawa和Kato方法，于光学显微镜下，确定HG:0级，无神经元死亡;1级，散在神经元死亡;2级，成片神经元死亡;3级，几乎全部的神经元死亡。取双侧平均等级作为统计值;ND:计数海马CAl区每1 mm2区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段取平均值作为统计值，根据海马CAl区HG和ND结果，反映DND的程度，对其组织学改变进行评价。②采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞，具体步骤参照产品说明书。③采用免疫组织化学染色(链酶菌抗生物素蛋白过氧化物酶法)检测caspase-3的表达。caspase-3及TUNEL阳性物质位于细胞核内，使胞核呈棕黄色，采用显微计数法(400×)，随机选取缺血海马5个视野，计算每1 mm2区段内TUNEL标记和免疫组化caspase-3显色阳性的细胞进行计数，根据两者的变化反映海马CAl区神经元凋亡程度。

2.4 统计学处理应用SPSS l1.5软件进行统计分析。数据用±s表示，单因素方差分析(One-Way ANOVA)及t检验进行组间比较，组织学分级采用多样本等级资料的秩和检验进行组间比较。以P＜0.05为差异有显著性的判断标准。

3 结果

观察各组大鼠海马CAl区神经元组织学分级(HG)的HG结果见表1，检测各组大鼠神经元密度ND结果见表2，神经元凋亡(TUNEL)阳性细胞个数及caspase-3的比较结果见表3。

表1 各组大鼠海马CA1区神经元组织学分级(HG)结果

表2 各组大鼠海马CA1区神经元密度ND结果(±s)

表2 各组大鼠海马CA1区神经元密度ND结果(±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与全脑缺血/再灌注损伤模型组比较，#P＜0.05;藏药高、低剂量组间比较，▲P＜0.05。

组别ND/(个·mm－2)183.667±6.408 3全脑缺血/再灌注损伤模型组30.333±4.885 4*藏药低剂量组48.500±12.629 3*#藏药高剂量组68.167±12.106 5*#▲假手术组

表3 各组大鼠海马CA1区TUNEL凋亡细胞和caspase-3表达的结果±s)

表3 各组大鼠海马CA1区TUNEL凋亡细胞和caspase-3表达的结果±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与全脑缺血/再灌注损伤模型组比较，#P＜0.05，藏药高、低剂量组间比较，▲P＜0.05。

组别凋亡细胞数/(个·mm－2)caspase-3/(个·mm－2)10.833±2.926 920.625±6.255 0全脑缺血/再灌注损伤模型组138.167±13.044 8*79.250±8.811 5*藏药低剂量组117.167±12.890 6*#61.625±10.528 0*#藏药高剂量组92.333±8.140 4*#▲54.125±12.710 4*#假手术组

3.1 假手术组大鼠海马CA1区的锥体细胞2至3层整齐排列、细胞形态正常，细胞膜、细胞核无缺损、且胞核圆，位于中央，部分细胞可见核仁，尼氏体，HG为0级，ND为183.667±6.408 3个/mm2。TUNEL及免疫组化染色浅，少见凋亡小体及核固缩，细胞核染色少见，TUNEL法计数凋亡细胞数为10.833±2.926 9个/mm2，caspase-3阳性染色细胞为20.625±6.255 0个/mm2。

3.2 全脑缺血/再灌注损伤模型组大鼠海马CA1区见明显的组织损伤，多数锥体细胞崩解，大量细胞碎片散布，存活的锥体细胞零星分布，部分细胞体积缩小，呈不规则形，核膜不完整、核仁不见，HG增高为3级，而ND显著性降低。TUNEL及caspase-3免疫组化深染，凋亡细胞(138.167±13.044 8)个/mm2和caspase-3阳性细胞(79.250±8.811 5)个/mm2数目明显增多，显著高于其它三组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3.3 藏药组大鼠海马CA1区锥体神经元HG级别降低、ND数目升高，组织损伤程度减轻，可见存活的锥体细胞增多，TUNEL阳性凋亡细胞和caspase-3染色细胞数目减少，检测藏药低、高剂量组大鼠海马CA1区神经元四项指标与假手术组和全脑缺血/再灌注损伤模型组的结果比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。藏药低、高剂量组间比较，后者作用强于前者，其中ND数、TUNEL凋亡阳性细胞数差异有统计学意义(P＜0.05)，HG、caspase-3表达差异无统计学意义(P＞0.05)。

4 讨论

藏药三味檀香汤散主要有檀香酮、檀香酸、水杨酸等成分;化学结构:醇类-檀香脑、醛类-糖醛、倍半帖-檀香烯;属性:行气活血、养心、安神、消炎、抗菌、镇咳、袪痰、补身、收敛。马祁生等［3］研究发现三味檀香汤散可能是通过增强抗氧化酶活性、清除氧自由基、保护心肌线粒体结构，改善缺血心肌能量代谢和功能，提高心肌细胞对缺氧损伤的耐受性。寇毅英等［4］研究发现三味檀香散可能通过抑制心肌iNOS水平，减少NO过量产生，从而削弱了NO的细胞毒性作用。本实验主要研究藏药三味檀香汤散是否有减轻全脑缺血/再灌注损伤模型后海马CA1区神经细胞死亡作用，为探讨该藏药是否有神经保护作用提供实验依据。

国内外大量研究发现，全脑缺血/再灌注损伤模型的发生机制与兴奋性氨基酸毒性、自由基损害、钙超载、NO的细胞毒性、血-脑屏障损害、炎性损害等多因素综合作用有关，全脑缺血/再灌注损伤模型引起细胞死亡有坏死和凋亡两种形式，许多研究已证实，海马CA1区锥体细胞会在全脑缺血/再灌注损伤模型后3～4 d出现、7 d左右逐渐发生完全的迟发性死亡(DND)现象，因此，本实验选择观察全脑缺血/再灌注损伤模型后7 d海马CA1区DND变化情况。实验发现全脑缺血/再灌注损伤模型组大鼠HG为3级，DN减少，表明锥体细胞发生明显的DND，模型复制成功。三味檀香汤散低、高剂量预处理后可见HG级别降低、ND数目升高，组织损伤程度减轻，且高剂量组效果好于低剂量组。

全脑缺血/再灌注损伤模型海马CA1区迟发性神经元死亡的主要形式是凋亡［8］，绝大部分细胞凋亡依赖于caspase的存在，caspase的功能有:灭活凋亡抑制蛋白、直接解体细胞结构、分解与细胞骨架构成相关的蛋白、瓦解核结构成核碎片。细胞凋亡的主要途径有两条:①内源性途径:Cyt-C从线粒体释放到胞浆后与dATP、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合成复合物，激活caspase-9，caspase-9切割后激活caspase-3，caspases-3是凋亡的最终执行蛋白，在细胞凋亡中起着最后枢纽的作用［9］;②外源性途径:Fas膜受体系统激活caspase-8，caspase-8直接激活caspase-3［10］。TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，是最常用的检测组织样品凋亡细胞的手段，但结果存在假阳性的缺点，所以本实验分别用TUNEL原位标记法和免疫组织化学法检测各组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡阳性个数和caspase-3表达的变化，反映全脑缺血/再灌注损伤模型后海马CA1区神经细胞凋亡程度，并可探索三味檀香汤散减轻细胞凋亡的发生机制。大鼠全脑缺血/再灌注损伤模型后caspase-3阳性细胞与凋亡阳性细胞高峰时间基本一致［11］，即I/R后24～48 h达高峰、72 h后开始下降。因此，本实验选择全脑缺血/再灌注损伤模型后3d进行细胞核内凋亡细胞、caspase-3基因阳性表达的检测。结果发现在全脑缺血/再灌注损伤模型模型组有大量TUNEL和caspase-3阳性细胞，而在藏药预处理灌胃大鼠的切片中TUNEL和caspase-3阳性细胞数目明显比I/R组减少。

本次实验结果提示藏药三味檀香汤散预防给药可能有减轻全脑缺血/再灌注损伤模型后海马CA1区DND、抑制caspase-3表达，进而起到神经保护作用。通过本实验也发现三味檀香汤散低、高剂量组间，后者作用强于前者，尤其对ND数、TUNEL凋亡阳性细胞数影响明显，对HG、caspase-3表达的影响差异无统计学意义。因此对于藏药三味檀香汤散的脑保护作用的详细机制以及预防和治疗给药的具体剂量、毒性反应等诸多问题还有待继续深入研究。

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［4］寇毅英，李永芳，杨梅，等.三味檀香散抗心肌损伤的作用及对一氧化氮的影响［J］.青海医学院学报，2010，31(1):40-44.

［5］陈芃，杨梅，李永芳，等.三味檀香散对实验性心肌缺血大鼠的保护作用研究［J］.青海师范大学学报:自然科学版，2008(3):383-386.

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