烘法与砂烫法炮制马钱子的比较研究

屈艳格，陈军，蔡宝昌，5*

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京210046;2.江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京210029;3.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏南京210029;4.国家中医药管理局中药炮制标准重点研究实验室，江苏南京210029;5.南京海昌中药集团，江苏南京210061)

马钱子，又名番木鳖，是马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿之功效［1-2］。马钱子中含有多种生物碱，其中马钱子碱和士的宁为主要的活性成分和毒性成分，两者合计在总生物碱中占70%以上。炮制后马钱子碱和士的宁的含有量下降，二者的氮氧化物含有量升高，其中马钱子碱氮氧化物活性很强但毒性远低于马钱子碱，是炮制后减毒不减效的主要物质基础［3］。临床应用以外用为主，口服必须炮制。传统的马钱子炮制方法有砂烫法、油炸法、烘法等，以砂烫法为主［4］，并且已经收入《中国药典》。由于砂烫法生产中受到限制，需要改革加工炮制方法，本实验尝试采用烘法代替砂烫法炮制马钱子，为马钱子炮制工艺的现代化改革提供实验依据。

1 材料

HP 1100 Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司);752紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱DHG9076A(上海精宏实验设备有限公司);乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司);其余试剂均为分析纯;马钱子碱对照品(批号110706-200505)，士的宁对照品(批号110705-200306)，均购自中国药品生物制品检定所;马钱子碱氮氧化物对照品(美国Sigma公司);马钱子购于浙江中医药大学中药饮片厂，经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 加工炮制方法

2.1.1 砂烫马钱子在锅内加入适量油砂，用电炉加热翻炒至230℃，投入马钱子适量，油砂掩埋并开始计时，有爆裂声时开始翻炒，炒至3 min，此时马钱子鼓起，爆裂并呈棕黄色，取出，放冷，即可［5］。

2.1.2 烘烤马钱子［6］采用烘箱烘烤(温度与时间见表1)。其中烘烤条件为加热215℃烘烤15 min的马钱子呈浅棕色至棕色，表面鼓起，质地坚脆，部分有开裂，内表面呈棕黄色至棕褐色。

表1 不同加热时间和温度下马钱子碱和士的宁测定Tab.1 Contents of brucine and strychni from Strychni Semen at different time and tempteture

2.2 马钱子炮制品中马钱子碱和士的宁的测定

按《中国药典》2010年版一部方法，采用HPLC法测定马钱子生品、砂烫制品及烘烤制品中马钱子碱和士的宁。结果生品中含马钱子碱1.38%，含士的宁2.02%;砂烫制品中含马钱子碱1.04%，含士的宁1.68%。烘烤制品结果见表1。结果表明，烘烤条件为215℃烘烤10、15 min;230℃烘烤5、10、15 min;250℃烘烤5 min的马钱子烘烤制品均符合药典规定，并用于以下实验比较。

2.3 马钱子中马钱子碱氮氧化物的测定［7］

2.3.1 色谱条件色谱柱为Superstar C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-［水-乙酸-三乙胺(100∶0.2∶0.2)］(B);洗脱条件为0～20 min(B90%→79%)、20～50 min(B79%→60%);检测波长254 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;进样量10 μL。

2.3.2供试品的制备精密称取马钱子砂烫制品和烘烤制品粉末(50目)约1 g，置50 mL锥形瓶中，加甲醇-水-浓盐酸(25∶1∶1)27 mL溶解，称定质量，超声(功率250 W，频率20 kHz)处理30 min，取出，再称定质量，补足丢失的质量，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.3 对照溶液的配制称取马钱子碱氮氧化物对照品适量，精密称定，至50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为10.07 μg/mL的对照品溶液。

2.3.4 线性关系的考察精密吸取马钱子碱氮氧化物标准溶液，用甲醇稀释得到0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL的系列标准溶液，进样，测定峰面积。以质量浓度(X)对峰面积(Y)作线性回归，得到马钱子碱氮氧化物的回归方程为Y=27.986X－12.286(r=0.999 3)，质量浓度范围为1～20 μg/mL。

2.3.5 精密度试验取马钱子碱氮氧化物对照溶液，重复进样6次。考察发现马钱子碱氮氧化物相对峰面积的RSD在0.39%。

2.3.6 重复性试验精密称取6份砂烫马钱子样品，按2.3.2项中供试品溶液制备方法制备，依上述条件测定，马钱子碱氮氧化物的相对峰面积的RSD在1.97%。

2.3.7 稳定性试验取砂烫马钱子供试品溶液，室温下放置，分别在0、1、4、8、12、24 h，马钱子碱氮氧化物相对峰面积的RSD在0.58%。

2.3.8 加样回收率试验取已知含有量砂烫马钱子样品，精密称定，分别加入一定量的马钱子碱氮氧化物对照品后，按2.3.2项方法制备供试品溶液，依法测定。结果见表2。

表2 马钱子碱氮氧化物加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery of brucine-N

2.3.9 样品测定按2.3.2项下制备样品，在所选色谱条件下测定不同处理样品中马钱子碱氮氧化物，结果见表3。其中烘烤条件为215℃15 min时的烘烤制品与砂烫制品中最接近。

表3 马钱子样品中马钱子碱氮氧化物的含有量(与生品比较)Tab.3 Contents of brucine-N from Strychni Semen compared to the raw one

2.4 马钱子中总生物碱的测定［8］

2.4.1 线性关系考察精密吸取经显色反应后的马钱子碱对照溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1.0 mL，于416 nm处测定吸光度(A)。绘制标准曲线:A=3.398 6C－0.025，r=0.999 8，质量浓度范围为0.042 3～0.212 mg/mL。取士的宁对照溶液同法操作，得回归方程A=3.809 5C－0.085，r=0.999 5，质量浓度范围为0.063 3～0.257 mg/mL。

2.4.2 精密度试验取样品溶液1份，比色后连续测定6次，计算，RSD=0.88%。

2.4.3 重复性试验取同一样品，平行操作，制备6份供试品溶液，平行比色测定，计算，RSD=0.69%。

2.4.4 加样回收率试验取砂烫马钱子样品，精密称定，分别加入马钱子碱、士的宁对照品后，同上述条件，进行测定。结果表明，马钱子碱的平均回收率为98.35%，RSD=2.9%;士的宁的平均回收率为100.04%，RSD=2.7%。

2.4.5 测定方法以马钱子碱计和士的宁计总生物碱含有量，结果见表4。结果表明烘烤条件为215℃烘烤15 min时的烘烤制品与砂烫制品中总生物碱最接近。

表4 马钱子生品、砂烫制品和烘烤制品中总生物碱含有量Tab.4 Contents of alkaloids of the raw and processed Strychni Semen

2.5 马钱子炮制品的聚类分析［9］

2.5.1 色谱条件、对照品溶液和供试品溶液的制备同2.3.1、2.3.2、2.3.3项下方法。

2.5.2 精密度试验取砂烫马钱子样品溶液，重复进样6次，测得各色谱峰对内参比色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.078%～1.821%和0.098%～2.682%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验取砂烫马钱子样品溶液，分别在0、1、4、8、12、24 h进样，测得各色谱峰对内参比色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验取砂烫马钱子样品，平行操作，按2.3.2项中供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，进样，测得各色谱峰对内参比色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.146%～1.665%和0.068%～1.958%，表明重复性良好。

2.5.5 共有峰的确定根据供试品溶液HPLC图谱给出的参数，比较供试品图谱，其中17个峰是各批供试品所共有的，因此，确定这17个峰为马钱子炮制品的共有峰。见图1。

图1 马钱子砂烫制品共有峰Fig.1 Common peaks of the Strychni Semen by stir-baked in sand

2.5.6 马钱子炮制品指纹图谱的聚类分析对马钱子炮制品作指纹图谱分析，获得包括士的宁(13号峰)、马钱子碱(14号峰)、马钱子碱氮氧化物(16号峰)的17个色谱峰，用SPSS软件作聚类分析，采用组间距离法进行分析，利用欧氏距离作为样品的测度。聚类谱系图见图2。聚类分析将马钱子炮制品分为3类，其中烘烤条件为215℃烘烤10、15 min;230℃烘烤10、15 min烘烤制品和砂烫制品为Ⅰ类;烘烤条件为230℃烘烤5min为Ⅱ类;烘烤条件为250℃烘烤5 min为Ⅲ类。

图2 聚类谱系图Fig.2 Clustering pedigree chart

3 讨论

3.1 烘法考察因素的选择曾对砂烫法炮制马钱子进行研究，发现主要的影响因素为加热温度和时间，其他因素对其影响不大，故选择加热时间和温度作为烘法的考察因素。

3.2 指纹图谱的聚类分析从聚类谱系图可以得出，马钱子炮制品可分为3类。由相似度软件计算得出，Ⅰ类烘烤制品与共有模式的相似度都在0.995～1.00之间，其中烘烤条件为加热215℃烘烤15 min与砂烫制品特征图谱相似度达到0.999以上;而Ⅱ类和Ⅲ类烘烤制品与共有模式的相似度在0.89、0.90，因此得到了两种不同测度间的互相认证。提示用烘法和砂烫法炮制马钱子，得到的炮制品中化成成分及含有量及其接近。

3.3 通过文献［10-11］研究马钱子烘法的炮制原理与砂烫法最为接近，主要通过加热使生物碱转化，从而达到减毒增效的目的。通常认为马钱子种皮上的茸毛“毒性大”“刺人咽喉”，故马钱子一般都要求去毛［12］。马钱子经烘烤后，质地坚脆，种皮上的毛易于脱落。因烘法在日常生产中具有工艺稳定，操作简单，劳动强度低，重现性好等特点，故本课题拟以烘法代替传统的砂烫法来炮制马钱子。本课题组通过对马钱子砂烫制品和烘烤制品中主要生物碱进行测定，指纹图谱的聚类分析，优选出烘烤制品的最佳条件为加热215℃烘烤15 min。提示用烘法和砂烫法炮制马钱子，得到的炮制品中化学成分及含有量及其接近。由于马钱子在临床上具有通络止痛，消肿散结之功效，关于马钱子烘焙制品与砂烫制品具体对抗炎、镇痛模型实验动物的药理作用结果，有待日后进一步考察。

综上所述，烘法只需掌握温度和时间，操作简单容易掌握，鼓风式加热受热均匀，较少受经验的影响。砂烫法炮制所用的油砂粒径不均一，传热程度不同;油砂的规格、干净程度没有统一标准;炮制过程不容易控制，炮制的重现性及产业化生产受到限制。与砂烫法相比，烘法可以提高工作效率，减轻劳动强度，节约燃料，降低成本，既适宜于小批量加工，更适合于大规模产业化生产，故烘法可以代替砂烫法作为马钱子的一种炮制方法。

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