鲜铁皮石斛HPLC特征图谱研究

魏刚，刘宏源，黄月纯，谢学新，杨丽娥，刘星华，刘东辉

(1.广州中医药大学，广东广州510405;2.广东永生源生物科技有限公司，广东饶平515736;3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405)

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科石斛属植物，始载于《神农本草经》，是药用石斛中的上品，功能益胃生津，滋阴清热，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨微软［1-2］。铁皮石斛野生资源日趋稀少，濒临灭绝。铁皮石斛组织培养、大田栽培的研究已取得一定的规模［3］。有研究表明，铁皮石斛组培品与野生品在植物形态及组织结构上基本相同，总多糖含有量无显著差异，表明铁皮石斛经组织培养和人工培植过程后药材性状和质量与野生药材相近，初步证明经过组织培养快速繁殖和人工培植铁皮石斛是解决其资源紧缺问题的有效途径［4］。铁皮石斛除加工成铁皮枫斗［2］外，鲜品作为保健食品的使用也逐步扩大。现代化学成分研究表明，铁皮石斛含有多糖类、生物碱类、联苄类衍生物、菲类化合物、黄酮类、氨基酸、微量元素等成分［3，5－6］。《中国药典》2010年版铁皮石斛的质量标准规定了总多糖(≥25.0%)和甘露糖(13.0%～38.0%)的含量测定方法［2］。鉴于高效液相(HPLC)指纹图谱在药材质量控制上的优势，殷放宙等［7］对云南思茅石膏井镇的10批铁皮石斛药材进行了HPLC指纹图谱初步研究。目前，尚较少对鲜铁皮石斛的质量分析报道［8-9］。本实验优化了铁皮石斛HPLC特征图谱分析方法，对不同产地鲜品铁皮石斛进行特征图谱的比较，为鲜铁皮石斛的质量控制提供方法依据。

1 仪器与试药

HP 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，光二极管阵列检测器(美国Agilent公司)。10批鲜铁皮石斛(编号为S1～S10)由广东饶平永生源有限公司等提供，产地分别为广东、云南、浙江、广西等地，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定系铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的新鲜茎。乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件采用Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相为乙腈(A)-0.2%的甲酸溶液(B)，梯度洗脱，0～20 min乙腈为0.5%→5%，20～80 min乙腈为5%→15%，80～150 min乙腈为15%→40%，150～155 min乙腈为40%→0.5%;检测波长为270 nm;柱温为35℃;体积流量为1.0 mL/min。

2.2 供试品溶液的制备精密称取鲜铁皮石斛粉末4 g，加适量硅藻土使分散，加80%甲醇50 mL，超声处理40 min，取出，放冷，滤过，药渣及滤纸剪碎同置于烧瓶中，加入80%甲醇50 mL，超声处理40 min，取出，放冷，滤过，合并两次滤液，减压蒸干，残渣用石油醚(60～90℃)浸泡两次，每次5 mL(浸泡约2 min)，倾去石油醚液，残渣加80%甲醇使溶解，置2 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明精密度良好。

2.3.2 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，分别在0、2.5、5、10、12.5、30 h进样，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明30 h内供试品溶液稳定性良好。

2.3.3 重复性试验取同一批样品6份，分别制备供试品溶液，进样分析，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明重复性良好。

2.4 样品检测精密吸取供试品溶液10 μL，依法进样分析。

2.5 特征图谱的建立与分析

2.5.1 共有峰的确定根据10批样品分析结果，鲜铁皮石斛主要有35个特征共有峰，以峰27为参照峰(S)分别计算各特征共有峰相对保留时间(RTR)与相对峰面积(RA)，结果峰号(平均相对保留时间、平均相对峰面积)分别为峰1(0.036、0.187)、峰2(0.079、0.090)、峰3(0.084、0.095)、峰4(0.120、0.230)、峰5(0.172、0.287)、峰6(0.192、0.105)、峰7(0.232、0.0334)、峰8(0.254、0.043)、峰9(0.296、0.028)、峰10(0.330、0.094)、峰11(0.393、0.073)、峰12(0.431、0.047)、峰13(0.485、0.032)、峰14(0.530、0.052)、峰15(0.644、0.054)、峰16(0.697、0.182)、峰17(0.772、0.082)、峰18(0.786、0.069)、峰19(0.816、0.153)、峰20(0.826、0.092)、峰21(0.843、0.066)、峰22(0.858、0.076)、峰23(0.916、0.088)、峰24(0.926、0.134)、峰25(0.944、0.180)、峰26(0.963、0.138)、峰27(1.000、1.000)、峰28(1.043、0.189)、峰29(1.065、0.140)、峰30(1.107、0.133)、峰31(1.122、0.078)、峰32(1.213、0.165±0.176)、峰33(1.235、0.070)、峰34(1.254、0.065)、峰35(1.378、0.070)。

2.5.2 相似度分析采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，以均值法分析，以10批鲜铁皮石斛特征图谱生成的共有模式为对照，分析各样品相似度，结果见表1。10批样品HPLC特征图谱重叠图及共有模式见图1～2。

表1 鲜铁皮石斛HPLC特征图谱相似度Tab.1 Results of similarities of HPLC characteristic spectrum of fresh Dendrobium officinale

图1 10批鲜铁皮石斛HPLC特征图谱重叠图Fig.1 HPLC characteristic spectrum overlapping of ten batches of fresh Dendrobium officinale

图2 鲜铁皮石斛HPLC特征图谱共有模式Fig.2 Common pattern of HPLC characteristic spectrum of fresh Dendrobium officinale

2.5.3 主要特征共有峰光谱紫外分析各特征峰的紫外光谱见图3，主要特征峰紫外光谱分四类，峰2、峰3、峰5、峰7属Ⅰ类，在202、265 nm附近有最大吸收;峰8、峰11、峰13、峰14属Ⅱ类，在207、270 nm附近有最大吸收;峰18、峰19、峰21、峰22、峰23、峰24、峰29、峰31属Ⅲ类，在200、220及280 nm附近有最大吸收;峰16、峰25、峰27属Ⅳ类，在220、270及340 nm附近有最大吸收，为黄酮类成分。

3 讨论

铁皮石斛多糖含有量高，其他成分多而含有量低，需筛选优化色谱条件与供试品溶液的制备方法，本研究筛选确定了分离效果较好的色谱柱(Zorbax SB-Aq C18)，流动相采用乙腈-0.2%的甲酸溶液的梯度洗脱系统，检测波长在270 nm条件下检出特征峰多。鲜铁皮石斛含糖多、黏性很大，不易粉碎，可将样品剪细置低温冰箱放置后，取出及时粉碎;粉末直接加溶媒后易结块，可先加适量硅藻土使分散;甲醇提取物含叶绿素多，可采用石油醚去脂处理。经实验确定了铁皮石斛以生药计质量浓度为2.0 g/mL。

通过10批鲜铁皮石斛的特征图谱分析表明，10批样品相似度大于0.9，表明鲜铁皮石斛具有较强的特征指纹峰，大部分峰形尖锐，分离度好。经紫外光谱分析，鲜铁皮石斛主要特征峰可分为四类，其中峰17～峰27为铁皮石斛比较专属的特征共有峰。

图3 鲜铁皮石斛HPLC指纹图谱特征峰紫外光谱图Fig.3 Ultraviolet spectra of the main peaks of HPLC fingerprints of fresh Dendrobium officinale

研究中发现，绝大多数样品的峰27为最强峰，但个别样品的峰27较小，可能为不同种质资源铁皮石斛存在的差异所造成。另外，铁皮石斛根据质地不同有软脚和硬脚之分，软脚类铁皮石斛多糖含有量较高，常加工成铁皮枫斗，硬脚类铁皮石斛常切断加工成铁皮石斛，初步研究软脚和硬脚类铁皮石斛基本具有类似的特征峰，不同种质资源铁皮石斛的区别有待于进一步深入研究。

本实验还对鲜铁皮石斛组培苗进行了初步分析，初步研究发现不同种质资源的铁皮石斛组培苗基本含鲜铁皮石斛类似的特征共有峰。由于组培苗基本为叶，特征峰相对峰面积与茎有较大差异，组培苗黄酮类特征峰面积相对较大。同一种质资源的原茎与其组培苗的特征图谱较为相似。研究初步表明鲜铁皮石斛HPLC特征共有峰成分能在组培苗中得到一定程度的体现，提示可通过分析鲜铁皮石斛或组培苗HPLC特征图谱优选较佳种质资源的原茎或组培苗。铁皮石斛从组培苗、炼苗到入田不同生长期周期的HPLC特征图谱相关性有待于进一步研究。

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