地肤子抗真菌化学成分研究

徐云辉，黄浩，郭兆霞，张念，孔德云，华茉莉

(上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海200040)

中药地肤子为藜科植物地肤Kochia scoparia(L.)Schard的成熟果实，具有清热利湿、祛风止痒之功效，用于小便涩痛、阴痒带下、风疹、湿疹、皮肤瘙痒等症［1］，临床多以复方入药［2-5］。现代一些药理实验显示其水煎剂及醇提物对一些皮肤真菌具有一定的抑制作用［6-7］。目前，对地肤子的生物活性物质基础研究相对较少，其抗真菌活性成分也并未见有明确报道。本研究采用超临界萃取与系统溶剂法，制备地肤子的不同提取部位样品，体外纸片扩散法药敏实验显示其正丁醇提取部位对白色念珠菌具有明显的抑菌活性。由此采用多种色谱分离方法对地肤子的正丁醇提取部位开展了化学成分研究，分离得到8个化合物，依据其理化性质及波谱数据分别鉴定为β-谷甾醇(1)，β-胡萝卜苷(2)，槲皮素(3)，金丝桃苷(4)，3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齐墩果酸(也称地肤子皂苷ⅠC)(5)，异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)，3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(也称地肤子皂苷ⅡC)(7)，3-O-［β-D-吡喃葡萄糖(1→2)β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齐墩果酸(8)，其中化合物3、4、6均为首次从该植物中分离得到。体外抗真菌活性测试显示，化合物8对白色念珠菌有一定抑制作用。

1 仪器和材料

MSD—Trap—XCT，Q—Tof micro(ESI-MS)型质谱仪(Agilent公司);DRX—500核磁共振仪(Bruker公司);WFH—203三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);Waters高效液相色谱仪(2487检测器，1525二元泵);硅胶H(烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂);Sephadex LH-20凝胶(安发玛西亚);ODS—A反相硅胶填料(日本YMC公司);Rf200中低压制备色谱(环球)。

地肤子购于上海雷允上中药饮片厂，批号2009100238，经上海医药工业研究院吴彤研究员鉴定为藜科植物地肤的果实。

白色念珠菌为上海医药工业研究院微生物部门保藏菌种。

2 提取分离

干燥地肤子药材4 kg，粉碎，经CO2超临界萃取除去油脂，药渣以80%乙醇回流提取3次，提取液浓缩，所得浸膏采用硅藻土拌样(1∶1)，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脱，所得甲醇部位再以水饱和正丁醇萃取得正丁醇部位。正丁醇部位(100 g)经硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，其95∶1洗脱部位经再次硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱)得化合物1(30.3 mg);其15∶1洗脱部位经乙醇重结晶得化合物2(35.5 mg)，其结晶母液部分经LH-20凝胶柱层析得化合物3(8.4 mg);其8∶1洗脱部位经再次硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析得化合物5(45.5 mg)，HPLC(甲醇-水系统)精制得化合物6(10.0 mg);其6∶1洗脱部位经再次硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析得化合物4(9.3 mg);其1∶1洗脱部位经再次硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析、中低压反相硅胶柱层析(甲醇-水梯度洗脱)得化合物7(84.5 mg)、化合物8(102.5 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:白色针晶(甲醇)，mp 140～141℃，Liebermann-Burchard反应呈阳性。经与β-谷甾醇对照品共薄层，在3种溶剂系统下展开Rf值均一致，混合后测定熔点不下降，故鉴定该化合物为β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末，mp 275～277℃，难溶于水、甲醇、三氯甲烷;Libermann-Burchard反应和Molish反应均呈阳性，经与胡萝卜苷对照品共薄层，在3种溶剂系统下展开Rf值一致，混合后测定熔点不下降，故鉴定该化合物为β-胡萝卜苷。

化合物3:黄绿色粉末，ESI-MS m/z:301［MH］－，325［M+Na］+，分子式C15H10O7。1H-NMR(MeOH-d4，500 MHz)δ:7.62(1H，s，H-2')，7.52(1H，d，J=8.0 Hz，H-6')，6.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6.27(1H，s，H-8)，6.07(1H，s，H-6)。13C-NMR(MeOH-d4，500 MHz)δ:177.5(C-4)，165.7(C-7)，162.7(C-5)，158.4(C-9)，148.9(C-4')，148.1(C-2)，146.4(C-3')，137.4(C-3)，124.3(C-1')，121.8(C-6')，116.3(C-5')，116.1(C-2')，104.6(C-10)，99.4(C-6)，94.5(C-8)。以上数据与文献［8］对照一致，鉴定为槲皮素。

化合物4:黄绿色粉末，Molish反应呈阳性，ESI-MS m/z:463［M-H］－，487［M+Na］+，301［M-162-1］－，分子式C21H20O12。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:7.60(2H，s，H-2'，H-6')，6.81(1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，6.38(1H，s，H-8)，6.17(1H，s，H-6)，5.33(1H，d，J=7.5 Hz，H-1')。13C-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:178.3(C-4)，164.9(C-7)，161.9(C-5)，157.2(C-9)，157.2(C-2)，149.0(C-4')，145.2(C-3')，134.4(C-3)，122.5(C-1')，122.0(C-6')，116.7(C-5')，115.7(C-2')，104.7(C-10)，103.0(C-1″)，99.2(C-6)，94.1(C-8)，76.5(C-5″)，73.9(C-3″)，72.0(C-2″)，68.7(C-4″)，60.9(C-6″)。以上数据与文献［9］对照一致，鉴定化合物为金丝桃苷。

化合物5:白色粉末，ESI-MS m/z:787［M+Na］+，763［M-H］－，碎片峰631［M-132-1］－，分子式C41H64O13。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.82，1.00，1.00，1.00，1.04，1.32，1.36(each 3H，s，7×CH3)，3.32(H-3)，4.92(1H，H-1 of Glc)，5.28(1H，H-1 of Xyl)，5.50(H-12)。13CNMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.3(C-5)，19.0(C-6)，48.5(C-9)，47.2(C-17)，47.0(C-19)，42.7(C-14)，42.5(C-18)，40.3(C-8)，40.0(C-4)，37.5(C-10)，34.8(C-21)，33.8(C-7)，33.0(C-22)，31.3(C-20)，26.7(C-2)，28.6(C-15)，28.8(C-23)，27.1(C-27)，24.3(C-30)，24.3(C-11)，24.3(C-16)，16.0(C-25)，17.5(C-24)，18.0(C-26)，89.7(C-3)，123.6(C-12)，145.4(C-13)，180.2(C-28)，Glc 107.0(C-1)，75.0(C-2)，86.3(C-3)，72.1(C-4)，78.5(C-5)，172.8(C-6)，Xyl 106.4(C-1)，75.4(C-2)，77.8(C-3)，71.3(C-4)，67.9(C-5)。以上数据与文献［10-11］对照一致，鉴定化合物为3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齐墩果酸。

化合物6:黄绿色粉末，ESI-MS m/z:477［MH］－，501［M+Na］+，315［M-162-1］－，分子式为C22H22O12。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.61(1H，s，5-OH)，8.02(1H，s，H-2')，7.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-6')，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6.44(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.51(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)，3.84(3H，s，3'-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:177.4(C-4)，164.5(C-7)，161.2(C-5)，156.4(C-9)，156.2(C-2)，149.4(C-3')，147.0(C-4')，133.1(C-3)，121.9(C-6')，121.1(C-1')，115.2(C-5')，113.5(C-2')，103.9(C-10)，101.6(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，75.9(C-2″)，73.1(C-5″)，71.3(C-4″)，67.9(C-3″)，60.3(C-6″)，56.0(3'-OCH3)。以上数据与文献［12］对照一致，鉴定化合物为异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物7:白色粉末，ESI-MS m/z:949［M+Na］+，925［M-H］－，碎片峰763［M-162-1］－，631［M-162-132-1］－，分子式C47H74O18。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.82，0.90，0.93，1.00，1.10，1.30，1.31(each 3H，s，7×CH3)，3.20(H-3)，5.04(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)，5.39(1H，d，J=7.5 Hz，H-1of Xyl)，5.43(H-12)，6.35(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)。13CNMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.2(C-5)，19.0(C-6)，48.5(C-9)，47.5(C-17)，46.7(C-19)，42.7(C-14)，42.3(C-18)，40.4(C-8)，40.0(C-4)，37.5(C-10)，34.5(C-21)，33.7(C-7)，33.0(C-22)，31.3(C-20)，26.7(C-2)，28.4(C-15)，28.8(C-23)，27.1(C-27)，24.2(C-30)，24.2(C-11)，24.2(C-16)，16.0(C-25)，17.5(C-24)，18.0(C-26)，89.8(C-3)，123.4(C-12)，144.7(C-13)，177.0(C-28)，Glc 107.3(C-1)，75.2(C-2)，87.0(C-3)，72.0(C-4)，78.6(C-5)，172.8(C-6)，Xyl 106.7(C-1)，75.8(C-2)，78.1(C-3)，71.6(C-4)，67.9(C-5)，Glc 96.3(C-1)，74.7(C-2)，79.9(C-3)，71.5(C-4)，80.4(C-5)，62.7(C-6)。以上数据与文献［10-11］对照一致，鉴定化合物为3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物8:白色粉末，ESI-MS m/z:949［M+Na］+，925［M-H］－，碎片峰793［M-132-1］－，分子式C47H74O18。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.78，0.98，0.98，1.02，1.08，1.26，1.32(each 3H，s，7×CH3)，3.29(H-3)，5.01(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)，5.44(1H，H-1of Xyl)，5.46(H-12)，5.76(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)。13C-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.2(C-5)，18.9(C-6)，48.4(C-9)，47.2(C-17)，46.9(C-19)，42.6(C-14)，42.5(C-18)，40.2(C-8)，41.1(C-4)，37.4(C-10)，34.7(C-21)，33.8(C-7)，33.7(C-22)，31.5(C-20)，26.7(C-2)，28.6(C-15)，28.6(C-23)，27.1(C-27)，24.2(C-30)，24.2(C-11)，24.2(C-16)，15.9(C-25)，17.2(C-24)，17.9(C-26)，90.1(C-3)，123.0(C-12)，145.3(C-13)，180.7(C-28)，Glc 86.3(C-3)，72.1(C-4)，79.1(C-2)，77.9(C-5)，106.0(C-1)，172.5(C-6)，Xyl 105.5(C-1)，75.8(C-2)，79.1(C-3)，71.4(C-4)，67.9(C-5)，Glc 104.3(C-1)，77.0(C-2)，79.0(C-3)，73.0(C-4)，79.7(C-5)，63.8(C-6)。以上数据与文献［10-11］对照一致，鉴定化合物为3-O-［β-D-吡喃葡萄糖(1→2)β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齐墩果酸。

4 体外抗真菌活性测试

4.1 供试品溶液制备取化合物5、7、8，分别以甲醇溶解，配制成5 mg/mL溶液，备用。

4.2 抗真菌活性测试采用纸片扩散法，分别吸取各供试品溶液10、20、40、80 μL于纸敏片(直径6 mm)上，吹干后贴在白色念珠菌培养基平板上，盖上陶瓦盖，同时设空白对照，置于28℃培养箱内培养20 h，测量其抑菌圈直径。结果显示化合物8对白色念珠菌生长具有明显抑制作用，其抑菌圈直径达分别为8 mm、9 mm、11 mm、16 mm，而化合物5和7基本不显示抑菌活性。

5 讨论

中药地肤子中含有较为丰富的皂苷类化学成分，已有化学研究也多集中于此，本研究首次从该植物中分离得到3个黄酮类化学成分，可为开展地肤子非皂苷类生物活性成分的研究提供了一定参考。

地肤子具有清热利湿、祛风止痒之功效，多以复方中药用于皮肤瘙痒等症，现代药理研究实验显示其水煎剂及醇提物对一些皮肤真菌有一定抑制作用，但其抗真菌活性成分并不明确。皂苷作为地肤子药材中的主要成分，本研究中对提取分离得到多个地肤子皂苷单体成分进行初步的体外抗真菌活性测试，结果显示其抗真菌活性程度不一，为深入开展地肤子皂苷类化学成分的抗真菌活性及其构效关系研究提供了一定的参考依据和研究基础。

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