分子生物学技术在一串红中的应用

李春楠，傅巧娟

(浙江省杭州市农业科学研究院 园艺研究所，浙江 杭州 310024)

一串红 (Salvia splendens Ker-Gaw1)，又名鼠尾草、西洋红、爆竹红、撒尔维亚等，在系统分类上属于唇形科 (Labiatae)鼠尾草属 (Salvia)植物，绿化生产上常作一年生栽培。原产于南美巴西，现已广泛分布于温带及亚热带地区，在我国各地广为栽培。一串红花瓣、花萼鲜红艳丽，色泽纯正，花序较大，花期长，在众多草花中表现突出，为我国城市园林中最普遍栽培的草本花卉，是我国节日布置的传统用花。而且一串红还具有良好的药用价值，全株均可入药，有凉血、清热、消肿等功效。

分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象，通过对生物大分子的结构、功能及其相互作用的运动规律的研究，从分子水平上阐明生命现象和本质的学科，包括基因组学、蛋白质组学等。近年来，分子生物学技术在动植物的各个领域得到了迅猛发展，在花卉的遗传机理、性状改良和新品种选育中发挥的作用愈加显著。现阶段我国花卉育种研究还很薄弱，尤其是现代生物技术在育种上的应用还很少，与国外发达国家相比差距很大，因此在传统育种的基础上利用现代生物技术尤其是利用基因工程开展草花育种研究迫在眉睫。对于一串红来说，目前已经从栽培管理［1-3］、组织培养［4-6］、病 原 菌 的 分 离 鉴 定［7-8］和 活 性 物 质 提取［9-12］等基础研究逐渐深入到分子水平上来，取得了一系列进展，现将分子生物学技术在一串红中的应用情况综述如下。

1 一串红的遗传多样性

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础。遗传多样性研究主要通过分子生物学技术来进行，如随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)［13-14］、限制性片段长度多态性 (restriction fra-gment length polymorphism，RFLP)［15］、扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism， AFLP)［16］、 单 链 构 象 多 态 性(single-strand conform-ation polymorphism，SSCP)［17］和相关序列扩增多态性 (sequence-related amplified polymorphism，SRAP)［18］等技术。

关于一串红的遗传多样性分析已有一些报道，田晔林等［19］利用RAPD技术对已收集和自育的一串红种质资源进行遗传多样性研究。以株高和花色不同为依据，选取 8个一串红品种 (系)，对RAPD谱带统计结果的聚类分析显示，花色、株型相近的品种 (系)亲缘关系较近，高株型品种(系)单独聚为一类。胡国富等［20］探讨了不同花色一串红的亲缘关系，以美国进口品种太阳神系列中的红、紫、红白相间、白等4种花色一串红为试材进行了RAPD研究，结果可把4种花色一串红划分为2大类:红色和红白双色聚为一类，然后和紫色聚在一起;白色单独为一类。从这种划分中可以看出，红色和红白双色亲缘关系较近，紫色距离红色亲缘关系较近，而白色和其他花色一串红关系较远，但与红白双色的距离较近。这些结果都表明，RAPD技术是检测一串红品种 (系)遗传多样性的有效工具。杨建玉等［21］利用 AFLP标记技术对株型突变体BN35-1、野生型BN35及4个商品种进行亲缘关系分析，以确定BN35-1与BN35的亲缘关系，又对北京地区常见鼠尾草属植物的7个种23份材料进行AFLP亲缘关系分析，为北京地区开展鼠尾草属植物的种间和种内远缘杂交提供了理论参考。然而，从目前的研究情况来看，一串红的实验材料品种 (系)最多只有8个，这对于了解一串红种质资源多样性的真实情况还远远不够。为此，本课题组收集了17个一串红品种并以此为实验试材，对一串红SRAP-PCR反应体系中的主要因子进行了优化分析，建立了适合一串红DNA的SRAPPCR扩增体系，64对引物组合中有37对引物的扩增产物在不同材料间具有明显的多态性，其中有1对引物组合的鉴别能力最强，可将所有的17份材料完全区别开，说明SRAP能够有效地揭示不同一串红品种基因组间的差异，可作为一串红品种鉴别的重要技术手段［22］。接下来利用 SRAP标记分析了这些材料的遗传多样性，进一步挖掘一串红品种间遗传基础的多态性信息，为一串红遗传改良和资源创新提供理论基础。

2 花色素苷相关酶和基因

植物的花朵表现出特定的颜色主要是花色素的积累效应，花色素的存在及其变化是植物花色表现的化学机制。花色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素和生物碱［23］，其中类黄酮类色素是起主要决定作用的色素。与花色形成相关的类黄酮有两类:一类是水溶性的花色素苷，产生的颜色范围从红色到紫色;另一类是黄色2-苯甲川基苯呋喃酮。花色素苷所占的比例在很大程度上能决定花的最终颜色［24］。一串红的花瓣和花萼为红色也是由花色素苷所决定，主要是一串红花葵苷 (Savlinin)。经ICMS分析，在其花瓣中，一串红花葵苷占52%，在花萼中为 50%［25］。Suzuki的实验组［26］对一串红花葵苷的生物合成途径做了深入研究，发现丙二酰转移酶是花葵苷形成过程的最后一个阶段起催化作用的关键酶，包括丙二酰转移酶Ss5MaT1和Ss5MaT2。丙二酰转移酶Ss5MaT1是植物通用酰基转移酶 (VPAT)家族的成员，Suzuki等［27］利用分子生物学手段对Ss5MaT1进行了研究，从一串红花瓣中提取酶的粗提物，经过硫酸铵盐析和多次过柱对Ss5MaT1分离纯化，并克隆了它的基因Ss5MaT1。估计 Ss5MaT1单体酶的分子量为46 k Da，cDNA编码了一个462个氨基酸的蛋白质。Suzuki等［28］又报道分离纯化了一串红花瓣中丙二酰转移酶Ss5MaT2，并克隆了Ss5MaT2基因，全长cDNA编码一个417个氨基酸的蛋白质，分子量46 346 Da。后 来，Li等［29］采 用 SSCP 方 法 对Ss5MaT1基因的多态性进行了研究，用RT-PCR方法从8种不同颜色一串红中扩增了长916 bp的Ss5MaT1基因片段，测序后发现8种一串红花中都存在此结构基因，而且同源性相当高，在绯红色、干红色、白色、红白双色、浅紫色、紫色中，该基因序列完全相同，仅在玫瑰红色和鲑鱼肉色两种花色中，此基因出现了一个点突变，改变了编码氨基酸的顺序，在玫瑰红色花中744 bp处的点突变导致异亮氨酸 (Ile)突变为苏氨酸 (Thr)，而鲑鱼肉色花中678 bp处的点突变导致缬氨酸 (Va1)突变成丙氨酸 (Ala)。这些基因上出现的点突变导致编码氨基酸的改变是否为花色发生变化的根本原因，还有待于进一步探究。

3 存在问题及发展趋势

在一串红用花需求不断增加的同时，也存在着一些问题。如市场上流行的一串红品种退化现象严重，主要表现为株形衰弱、花量少、花色退变、花期长短不一、开花时间不一致;一串红颜色比较单一，只有红色系、白色系和紫色系等;要提高一串红的园林利用价值，就必须创造出新的花色［25］;一串红对温度反应比较敏感，温度超过30℃，植株生长发育受阻，花、叶变小，花瓣花萼极易脱落［30］。这些问题都严重影响了一串红的观赏价值，降低了经济效益。因此，选育抗性较强、颜色多样、株型美观、开花整齐、色泽艳丽的一串红新材料，是今后一串红品种选育和观赏性状改良的主要目标。

目前对一串红的研究还停留在基础水平，分子生物学技术在一串红遗传改良和辅助育种上的应用尚浅。利用分子生物学方法有望解决一串红花色单一、不耐高温等问题，如利用反义RNA或共抑制技术抑制相关基因的活性。荷兰自由大学首先用反义RNA技术 (反义的ChsA基因)改变了矮牵牛的花色，转化株出现了各种深浅花斑和开白花的品种［31］，这种技术同样可以用于一串红的花色改良，创造新的花色;另外，利用植物转基因技术提高植物抗逆性已经成为培育花卉新品种的一种趋势，引入外源基因可定向修饰花卉的某些性状或获得某种能力 (如耐高温)而不改变其他性状，且花卉转基因不涉及食品安全问题而比较容易被公众所接受。现在已经获得转基因植株的花卉有矮牵牛(Petunia)、 香 石 竹 (Dianthus)、 菊 花(Dendranthema)、百合 (Lilium)、玫瑰 (Rose)、郁金香 (Tuip)、非洲菊 (Gerbra)、金鱼草(Antirrhinum majus)、丝石竹 (Gypsophila)、月季(Rosa chinensis)、石 斛 (Dedrobium)、虾 脊 兰(Calanthe)、草原龙胆 (Eustoma grandiflorum)、水仙 (Narcissus)、天竺葵 (Pelargonium)、唐菖蒲、安祖花 (Anthurium)、伽蓝菜 (Kalanchoe laciniata)、仙客来 (Cyclamen persicum)、智利喇叭 花 (Salpiglossis sinuata)、 杜 鹃 花(Rhododendron)、向日葵 (Helianthus annus)、连翘 (Forsythia suspensa)等［32］，然而转基因技术对一串红的性状改良等研究还未见报道。DNA分子标记不但可以进行品种鉴定和种质资源亲缘关系分析，还可以关联与某些农艺性状相关的基因［33-34］，进而辅助花卉育种，缩短育种年限，分子标记关联分析在很多花卉中已经得到成功应用［35-36］，但对于一串红的研究，分子标记仅限于亲缘关系分析和品种鉴别等方面，与观赏性状的关联分析仍未见报道。

随着分子生物学的发展，分子标记技术将与比较基因组学和功能基因组学等学科相结合，在花卉品种鉴定、资源创新、辅助育种选择等多个领域发挥越来越重要的作用。伴随对花色素生物合成途径的深入了解，以及过程中各种酶的结构基因和调节基因功能的进一步研究，以基因工程技术为核心的花色基因的研究，将为人为设计并创造花色提供了无限的可能性，展示了美好的发展前景。一串红的分子育种工作仍处在起步阶段，将基因工程、蛋白质工程等分子生物学技术应用到一串红新品种选育中的前景非常可观，将有助于一串红优良观赏性状的定向选择，使分子育种更具方向性，为一串红资源创新提供辅助选择工具和理论指导。

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