利心冲剂对心衰大鼠血流动力学和凋亡相关基因表达的影响

解金洪，姜卫东，高 想，蒋凤荣，张锋莉

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一种复杂的临床症状群，是多种心血管疾病的终末阶段，其发病率和病死率较高。近几年，我科在中医理论指导下组方的利心冲剂，经临床对慢性心力衰竭的治疗观察，其能减轻症状，提高疗效，改善患者生活质量［1］。但其作用机制尚不十分明确。本实验观察利心冲剂对心力衰竭模型血流动力学、凋亡相关基因Bax、Bcl－2的影响，探讨其对抗心衰的分子作用机制。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂 利心冲剂主要由黄芪、黄精、补骨脂、葶苈子等组成，江苏南通市中医院提供；阿霉素，深圳万乐药业有限公司生产（批号：0505031），卡托普利，中美上海施贵宝制药公司生产（批号：0308E2）。抗体由美国B＆R提供，引物由上海生物工程公司提供，SOD、MDA试剂盒由南京建成生物工程公司提供。其他化学试剂均为分析纯。

1．2 动物分组及造模 取50只Wistar大鼠，健康SPF级雄性10周龄Wistar大鼠108只，体重300g±20g，购于中国科学院上海实验动物中心，实验动物质量合格证号：SYXK（沪）2007－2008。适应性喂养7d后，随机取10只（雌、雄各半）作为正常组，腹腔注射等体积生理盐水，给药容积同阿霉素（ADR）。余40只大鼠用ADR造模，用药量4mg／kg，每5d注射一次，共3次。末次ADR给药24h后，随机选取模型鼠2只，断头处死，取出心脏，用预冷生理盐水冲洗，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察确认造模成功后，再将所余大鼠随机分为心衰模型对照组。卡托普利治疗组6．3mg／（kg·d），利心冲剂低剂量治疗组20g／（kg·d）、利心冲剂高剂量治疗组40 g／（kg·d）。各组均精饲料喂养，自由饮水。

1．3 给药方法 卡托普利治疗组、利心冲剂低剂量组、利心冲剂高剂量组造模后次日开始灌胃给药，连续给药21d。正常组及模型组均灌胃等体积的生理盐水。

1．4 观察项目及检测方法

1．4．1 血流动力学测定 实验结束后，禁食12h，称重，麻醉后手术游离右侧颈总动脉，经右侧颈总动脉插入心室插管（充满1%肝素），用成都仪器厂RM6280C多道生理信号采集处理系统描记记录血压曲线；再继续插入，通过左侧动脉瓣和房室瓣进入左心室，描记记录左心室收缩压（LVSP）、左室舒张末期压（LVEDVP）、左心室内压最大上升速度（＋dp／dt max）及最大下降速度（－dp／dt max）等数据，观察血流动力学变化。

1．4．2 病理学检查 给药结束后，放血处死大鼠，取部分左室心肌，以10%甲醛固定，常规石蜡包埋，病理切片，HE染色，光镜观察。

1．4．3 Real－time PCR 定量检测凋亡 相关基因 Bcl－2、Bax的mRNA表达 取新鲜心室组织，总RNA的提取，采用Promega公司试剂盒提取总RNA，紫外线扫描定量。PT－PCR以Oligo（DT）为引物，加入总RNA 1μg，72℃10min后，依次加入无RNase水，10× RT buffer，25mmol／LMgCl2，250 μmol／L dNTPs，RNasin和AMV逆转录酶，反应体系为20μL，42℃保温15min生成cDNA，在8联管中加入Green7．5μL，引物（Bcl－2、casepase3、sod1、sod2、pgc－1a）0．6μL，cDNA2．5μL，无 RNase水4．4μL在real time PCR仪上扩增。比较Ct法（△△Ct法）分析结果。实验所用引物（见表1）。

表1 实验所用引物

2 结 果

2．1 心肌细胞病理学变化 正常对照组心肌细胞形态正常，胞浆纹理清晰；模型组部分心肌细胞水肿，脂肪变性，部分心肌细胞肌坏死、间质出血；利心冲剂高剂量组心肌细胞排列紧密，胞浆纹理清晰，无明显变性，心肌细胞肿胀／断裂。

2．2 大鼠心衰各组血流动力学测定 ADR作用后血流动力学指标LVSP、＋dp／dt max降低和LVEDP、－dp／dt max升高（P＜0．05），显示心功能受损；治疗后心脏血流动力学指标得到改善，以阳性药物组与利心冲剂高剂量组最为明显（P＜0．05）。表明利心冲剂能改善心衰大鼠的血流动力学，改善大鼠心功能。详见表2、表3。

2．3 大 鼠 心 衰 各 组 凋 亡 相 关 基 因 Bcl－2、Bax／Bcl－2 的 改 变（见图1） 阿霉素作用后 Bcl－2明显降低（P＜0．01）；Bax／Bcl－2比值＞1，促进细胞凋亡；利心冲剂治疗后Bcl－2明显升高，以高剂量最为明显（P＜0．01），Bax／Bcl－2比值＜1，抑制心肌细胞凋亡。

表3 各实验组血流速度变化（±s） m／s

表3 各实验组血流速度变化（±s） m／s

组别 n ＋dp／dt max －dp／dt max正常组6 5 926．27±43．95 4 566．33±48．09模型组 6 4 071．00±48．831） 3 191．67±24．661）卡托普利组 6 5 138．33±57．392） 3 943．00±114．052）利心低剂量组 6 4 528．00±76．61 3 516．33±55．11利心高剂量组 6 5 036．17±72．862）3） 4 051．83±120．512）3）与空白组比较，1）P＜0．05；与模型组比较，2）P＜0．05；与卡托普利组比较，3）P＜0．05。

表2 各实验组左心室压力变化（±s） mmHg

表2 各实验组左心室压力变化（±s） mmHg

组别 n LVSP LVEDP正常组6 169．33±6．65 4．73±0．35模型组 6 109．50±5．091） 19．42±1．411）卡托普利组 6 163．17±9．992） 9．17±0．752）利心低剂量组 6 148．33±6．02 18．10±0．46利心高剂量组 6 153．67±6．562） 12．00±0．922）3）与空白组比较，1）P＜0．05；与模型组比较，2）P＜0．01；与卡托普利性对照组比较，3）P＜0．05

图1 各组凋亡相关基因 Bcl－2、Bax／Bcl－2mRNA 变化量

3 讨 论

从心衰临床表现看，属中医“心悸”、“喘证”、“水肿”等病证范畴。多数研究者认为本病属本虚标实之证，本虚为心气虚、心阳虚，标实为血瘀、水阻、痰饮。在临床工作中以益气补肾利水为法则，组建利心冲剂治疗心衰，取得了满意的临床疗效，临床心功能得到明显好转，血清检测BNP等指标明显改善。

ADR属葱环类化合物，ADR复制心衰模型已经得到公认［2］，ADR作用后表现为LVSP、＋dp／dt max降低和LVEDP、－dp／dt max升高（P＜0．05），显示心功能受损；治疗后心脏的血流动力学指标得到改善，以阳性药物组与利心冲剂高剂量组最为明显（P＜0．05）。表明利心冲剂能改善心衰大鼠的血流动力学，改善大鼠心功能，进一步验证了利心冲剂治疗慢性心力衰竭的临床疗效。

近年研究发现，凋亡所致心肌细胞的死亡与病理性的心室重构密切相关。凋亡是心肌细胞死亡的形式之一，在CHF的发生发展中起到重要作用［2］。Bcl－2家族是细胞凋亡最重要的调控因子之一，在细胞凋亡通路中发挥着重要的调节作用［3］。Bax与Bcl－2是一对常用的促凋亡和抗凋亡基因，Bax／Bcl－2比值大于1时，促进心肌细胞凋亡；比值小于1时，抑制心肌细胞凋亡［4］。本实验模型组病理形态学显示，心肌细胞呈一定量的凋亡，凋亡相关基因 Bcl－2明显降低，Bax／Bcl－2比值增高，提示ADR能通过激活凋亡家族基因诱导凋亡。经利心冲剂治疗后，以上病理及病理生理学的改变均得到一定的改善，利心冲剂减少心肌细胞凋亡，改善心肌重构，改善血流动力学，降低Bax／Bcl－2比值，抑制凋心肌细胞凋亡，对心衰心肌细胞起保护作用。

本实验结果显示，利心冲剂能改善心衰大鼠的血流动力学，改善大鼠心功能，通过增加Bcl－2的表达，Bax／Bcl－2比值降低，抑制了心肌细胞凋亡，使心力衰竭得以改善，这种抑制心肌细胞凋亡的作用可能是通过调节凋亡相关基因实现的。

［1］高想，倪卫兵，陶志强，等．中西医结合治疗慢性心力衰竭60例临床观察［J］．江苏中医药，2007，39（6）：32－33．

［2］Schulze PC，Spate U．Insulin－like grouth factor－1and muscle wasting in chronic heart failure［J］．Int J Biochem Cell Biol，2005，37（10）：2023－2035．

［3］古晓娜，刘占旗，战景明．MAPKs在Bcl－2家族调控细胞凋亡中的作用［J］．国外医学：卫生学分册，2008，35（2）：65．

［4］Oltvai ZN，Milliman CL．Korsmeyer SJ．Bcl－2helerodimerizes in vi

vo with a conserved homoiogen，Bax，that accelerates programmed cell death［J］．Cell，1993，74（4）：609－619．