miR－145抑制VSMC增殖的作用及其相关信号通路研究

王泽慧，边云飞，肖传实

血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖是高血压血管重构以及血管增殖性疾病，如动脉粥样硬化、经皮腔冠状动脉介入治疗术（PCI）后再狭窄、血管移植术后新生内膜增生等发生发展的主要病理基础。

microRNA可以调节多种基因的表达。近年来发现miR－145是正常动脉中含量最丰富的miRNA，且主要聚集在VSMC［1］。miR－145在原代培养的VSMC中含量最丰富而在去分化的VSMC中的表达是下调的［2］。本实验室前期已经成功构建了大鼠miR－145重组慢病毒载体并在去分化型VSMC中过表达，但是miR－145是否能抑制去分化型VSMC增殖及其机制仍不清楚。故本实验以体外培养的大鼠原代VSMC为模型，应用PDGF－BB作为外界刺激因子诱导VSMC增殖，同时用构建好的大鼠miR－145重组慢病毒载体浸染目的细胞，CCK－8法检测细胞增殖情况，并在分子水平探讨miR－145是否通过抑制PDGF激活MAPK途径从而抑制VSMC增殖，从而为其抑制VSMC增殖的作用机制提供新的思路及实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料 山西医科大学实验动物中心提供健康SD大鼠，体重110g～130g；DMEM细胞培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；PDGF－BB购自美国PEPROTECH公司；CCK－8试剂购自碧云天公司；TRIzol、逆转录试剂盒、RT－PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；引物设计与合成由上海吉玛公司完成；蛋白提取试剂盒购自北京普利莱公司；PVDF膜购自北京索莱宝公司；磷酸化ERK1／2和总ERK1／2抗体购自北京博奥森公司；磷酸化JNK和总JNK抗体、磷酸化p38MAPK和总p38MAPK抗体均购自美国Cell signaling technology公司；羊抗兔二抗购自Santa公司；marker购自富酶泰斯生物技术（深圳）有限公司；Ecl－plus发光试剂盒购自武汉博士德公司；其他试剂均系进口或国产分析纯。

1．2 方法

1．2．1 大鼠原代VSMC培养 采用组织块贴壁法培养VSMC，传代后对VSMC进行抗αSM－actin免疫细胞化学染色鉴定。选择3～8代进行实验。

1．2．2 实验分组 将细胞分为4组。空白对照组：培养的大鼠原代VSMC不做任何处理。PDGF－BB组：大鼠原代VSMC中加 入 终 浓 度 为 10g／mLPDGF－BB。PDGF－BB＋ miR－145组：细胞转染miR－1 4 5慢病毒载体7 2h后加入终浓度为1 0 g／mLDGF－BB。miR－NC组：细胞转染阴性慢病毒载体。

1．2．3 CCK－8法测细胞增殖 收集对数期细胞种96孔板，每孔加入100μL细胞，边缘孔用无菌PBS填充，加入各组中的药物及慢病毒，每孔100μL，每组设5个复孔。5%CO2，37℃孵育48h。每孔加入10μLCCK－8溶液继续培养1h～4h。酶标仪在450nm波长处测每孔的光密度值。

1．2．4 细胞RNA提取和RT－PCR反应 使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，逆转录反应得到对应细胞的cDNA模板，采用SYBR Green法进行Real－time PCR检测，反应体系为20 μL，包含上下游引物、DNA 模板、Taq DNA polymerase和ddH2O。定量反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火31s，进行40个循环。各组PCR均重复3次。使用凝胶成像系统分析结果。mRNA的相对表达量用2－△△Ct方法来表示，其中△Ct＝Ct目标mRNA－CtGAPDH，△△Ct＝△Ct处理－△Ct对照。

1．2．5 Western印迹方法检测 ERK1／2 和 p－ERK1／2等的表达 用Bradford法测蛋白浓度。5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移至硝酸纤维膜（PVDF膜），依次加入兔抗鼠ERK1／2和p－ERK1／2抗体（1∶2 00）、兔抗鼠JNK和p－JNK抗体（1∶2 000）、兔抗鼠p38MAPK和p－p38MAPK（1∶2 000）浸泡滤膜，4℃过夜，洗涤后加入碱磷酶标记的羊抗兔IgG（1∶3 000），洗膜后ECL化学发光试剂检测。定量分析采用分子生物学图像分析系统。

1．3 统计学处理 采用SPSS13．0软件，用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结 果

2．1 miR－145对PDGF诱导VSMC增殖的影响 CCK－8结果显示，与空白对照组比较，miR－NC组OD值无统计学意义；PDGF组OD值明显升高（P＜0．05），PDGF可促进VSMC增殖。与PDGF－BB组比较，PDGF－BB＋miR－145组OD值明显下降（P＜0．05），提示miR－145可抑制PDGF诱导的VSMC增殖。详见表1。

表1 miR－145对VSMC增殖影响的CCK－8结果（±s）

表1 miR－145对VSMC增殖影响的CCK－8结果（±s）

组别 CCK－8（OD）空白组0．855±0．062 miR－NC组 0．777±0．058 PDGF－BB＋miR－145组 0．545±0．0351）PDGF－BB组 1．374±0．0861）2）与空白组比较，1）P＜0．05；与PDGF－BB＋miR－145组相比，2）P＜0．05

2．2 miR－145对VSMC相关基因的影响 RT－PCR结果显示：与空白对照组比较，miR－NC组PCNA、c－Jun及SM22amRNA的表达无统计学意义，PDGF组PCNA、c－Jun mRNA的表达分别上调1．37倍和2．68倍（P＜0．05），而SM22amRNA的表达下调80%（P＜0．05）。提示PDGF可促进 VSMC增殖抑制VSMC分化；与 PDGF－BB组比较，PDGF－BB＋miR－145组 PCNA、c－Jun mRNA 的表达分别下调66．4%和77．2%（P＜0．05），而SM22amRNA 的表达上调4．4倍（P＜0．05）。提示miR－145可抑制PDGF诱导的VSMC增殖而促进VSMC分化。

2．3 miR－145对PDGF诱导的p－ERK／ERK 蛋白表达的影响

Western－blot结果显示：PDGF－BB（10ng／mL）诱导 VSMC后，p－ERK水平明显上调，与对照组相比有统计学意义（P＜0．05）。转染 miR－145干预72h后再加入 PDGF－BB刺激，p－ERK水平明显下调，与PDGF组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。空质粒组与对照组相比无统计学意义。详见图1。

图1 miR－145对PDGF诱导的p－ERK／ERK蛋白表达的影响

2．4 miR－145对PDGF诱导的p－JNK／JNK蛋白表达的影响Western－blot结果显示：PDGF－BB（10ng／mL）诱导 VSMC后，p－JNK水平明显上调，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。转染 miR－145干预72h后再加入PDGF－BB刺激，p－JNK 水平明显下调，与PDGF组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。空质粒组与对照组相比无统计学意义。详见图2。

图2 miR－145对PDGF诱导的p－JNK／JNK蛋白表达的影响

2．5 miR－145对 PDGF 诱导的 p－p38MAPK／p38MAPK 蛋白 表 达 的 影 响 Western－blot结 果 显 示 ：PDGF－BB（1 0 ng／mL）诱导VSMC后，p－p38MAPK水平明显上调，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。转染miR－145干预72h后再加入PDGF－BB刺激，p－p38MAPK水平明显下调，与PDGF组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。空质粒组与对照组相比无统计学意义。详见图3。

图3 miR－145对PDGF诱导的p－p38MAPK／p38MAPK蛋白表达的影响

3 讨 论

VSMC由分化表型向去分化表型转化是VSMC增殖与迁移的关键性起始步骤，这是许多血管增生性疾病如：动脉粥样硬化、高血压和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄等疾病共同的细胞病理基础之一。microRNA是近些年来研究的热点之一，而miR－145受到关注是由于它在许多癌症中的表达下调，能够抑制癌细胞增殖，是一种新发现的抑癌基因［3，4］。然而，miR－145能否抑制VSMC的增殖仍不清楚。miR－145是VSMC一个重要的表性标记物和表型调节剂，能够抑制新生内膜的形成［1］。但是抑制新生内膜形成的具体机制尚未阐明。因此，进一步研究miR－145抑制VSMC增殖的机制是本次研究的重点。

细胞增殖是一系列基因有序调控的结果，在许多病理情况下，外界环境造成某些生长因子（如PDGF）增多，通过刺激信号转导网络调节某些基因表达增多，使VSMC的增殖失控，引起一系列病理改变［5］。MAPK是刺激脊柱类动物细胞增殖、分化的信号在细胞内传递的交汇点或共同通路［6，7］。PDGF能够吸引血管中层平滑肌向内膜下迁移，使VSMC从收缩型变为合成型，合成型（即去分化型）VSMC有很强的增殖能力及更高的MAPK水平［8］。PDGF通过受体酪氨酸酶途径激活静止期VSMC的 MAPK［9］，MAPK 激活转录因子，增加 VSMC的DNA合成，促进细胞增殖［10］。miR－145能否通过抑制去分化型VSMC中的MAPK信号通路，进而抑制VSMC的增殖尚不清楚。本实验测CCK－8比较PDGF组和转染miR－145慢病毒载体再给PDGF组的VSMC增殖情况；RT－PCR说明miR－145抑制增殖的机制与VSMC相关基因的表达有关；同时做western blot说明miR－145抑制PDGF诱导的VSMC增殖的机制与其抑制MAPK通路中的p－ERK／ERK、p－JNK／JNK、p－p38MAPK／p38MAPK蛋白的表达有关。

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［10］尹小龙，吕俊升．丝裂原激活蛋白激酶与血管平滑肌细胞增殖的信号转导［J］．国外医学：生理、病理科学与临床分册，1997，17（2）：113－115．