MicroRNA和肿瘤

曹长运 孙凤林（审校）

哈尔滨医科大学附属第三医院胸外科，黑龙江哈尔滨 150081

恶性肿瘤是当今医学上尚未攻克的难点和重要课题，其危害之大不言而喻。近年来关于MicroRNA（miRNA）在肿瘤领域的研究一直比较热门，miRNA是1993年在线虫体内发现的一种内源性、非编码的单链小分子RNA，长度为21～25 nt（少数小于20 nt）[1-2]。当前研究表明，miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ转录成初级转录物（pri-miRNA），后经Drosha酶剪切形成miRNA前体（pre-miRNA），最后在Dicer内切酶作用下产生成熟的miRNA[3-4]。miRNA通过与靶mRNA的3'UTR（Untranslated regions）互补结合，从而诱导其靶点mRNA的降解或翻译抑制[4]。自此以后，miRNA在大量生物物种中被发现，无论是在细胞的活动及组织的发生，还是在生长发育、肿瘤的发生等这些过程中都有一定的功能[4]，可以说它目前及以后的功能、意义有待进一步研究。miRNA在各种生物体中的广泛发现及其在调控基因表达中所发挥的重要生物学作用的逐步确证，使非编码RNA在生命中的重要作用得到了彻底的认可。

1 miRNA的生物学功能

miRNA是一种与其他蛋白质编码基因的mRNA转录本反向互补的小单链RNA基因。这些miRNA能够抑制蛋白质编码基因的表达。miRNA最先是在线虫中观察到的与靶转录物的3′UTR互补的小分子RNA，包括lin-4[2]和let-7[3]基因，线虫的发育有这些RNA基因所调控。随后miRNA被发现在包括从线虫到果蝇以及人的多种组织中存在[5]，提示这些分子可能代表一个从古老的非编码RNA（sRNA）祖先进化而来的基因家族。目前已经在动物和植物体中发现大量的约22 nt的miRNA，并证实均为与lin-4类似的内源性非编码小RNA。显然，miRNA介导的基因调控模式可能是在动植物界中保守存在的一类重要的基因调控机制[6]。成百上千的miRNA已经通过实验及生物信息学的方法得以鉴定，而且其中大多数在细胞里都具有高拷贝数的表达，提示miRNA是一类动植物基因组中含量丰富的基因调控分子[3,5,7]。更重要的是，一些miRNA显示出重要的生物功能。据预测，每一个miRNA似乎都有可能调控着大量的靶基因[8]。因此，miRNA可能具有多种生物学功能，并调控着广谱的蛋白编码基因。这表明miRNA介导的基因调控代表了一种转录后水平基因调控的基本模式，该模式可能存在于所有的生物学过程中。然而，大部分已知miRNA的生物学功能及其靶基因尚未明确。

2 MicroRNA在肿瘤中的作用

miRNA是一类小胞质RNA，它可以通过抑制翻译或者指导转录物降解的方式调节其他基因的表达[9]。第一个miRNA是在线虫（C.elegans）中识别到的，是鉴定改变发育时间的突变体时遗传筛选的结果[10]。随后，人们发现了miRNA广泛参与调控真核生物的发育和代谢过程，包括两侧的不对称性、凋亡、细胞增殖、脂肪代谢、胰岛素分泌、应激反应和开花[11-12]。在哺乳动物中，研究者们正在评估miRNA在疾病发生中的作用。miRNA参与调控基本的细胞过程，例如细胞分化和增殖。许多miRNA基因位于与疾病相关的基因位点的附近，而且在癌症发生过程中有差异表达，这些认识表明miRNA参与调控包括癌症在内的多种疾病[10,13-14]。miRNA和癌症有关的报道出现于2002年，报道了癌细胞特异的miRNA缺失或表达下调[15]。紧接着一系列的报道指出在各种癌细胞中许多miRNA分子的表达都有显著的降低[11-12,15]，但也有很少的miRNA分子表达是上调的[16-17]。现在这样说法已经有更多的证据支持，即虽然特殊的miRNA在某种癌症可上调[18]，但普遍的miRNA下调是人类恶性肿瘤的共同特征，发挥着表型转变的因果作用[19]。这种现象机制和它所提供的优势仍然知之甚少。miRNA协调整个基因簇的表达，控制哺乳动物转录组成规模[20]。大量的证据表明，在癌症中miRNA的表达是失调能力的，是被其他机制抑制的，miRNA的基因座通过遗传和表观遗传缺陷来体现出来的，miRNA作为一种特殊的标志，可以作为肿瘤分类和临床预后[21]。然而，很少有人知道其基本机制。最近有学者深入的研究了这个问题，笔者找到一个microRNA家族，miR-103/107抑制在Dicer酶的表达，造成普遍的miRNA下调。miR-103/107促进EMT特点，对乳腺癌细胞迁移有关和转移传播[22]。

现在越来越多的证据显示miRNA（包括miR-15/miR-16、let-7及miR-155/BIC等）的失调与某些类型的癌症相关[11,15-16]。并且，miRNA表达模型被用来特异地区分几种人类癌症[23]。虽然miRNA在癌症中确切的生物学作用还不为人所知，但是最近指出有些miRNA被c-Myc调节，c-Myc基因的失衡和功能是人类恶性肿瘤最常见的异常表现之一。近年来，肿瘤的基因遗传背景越来越受到重视，已经有研究者应用miRNAs来分类肿瘤[24]。一般来说，一个miRNA调节了上百个下游基因，所以，对比基因表达谱，肿瘤的miRNA表达谱将是更有潜力的肿瘤分型依据[19]。有研究报道，miR-378在众多的肿瘤细胞系中过表达[25]，在胶质瘤和肺癌等肿瘤的研究中，有报道miR-328、miR-378等能够增强肿瘤的血管生成作用，促进肿瘤远处转移[26-27]。基因-miRNA相互作用，也许在肿瘤的发展和发生中起到非常重要的作用。如果癌症通过持续的积累和遗传选择以及表遗传改变逐渐发展，使细胞生存、复制，从而建立能抵抗凋亡的不正常增殖模式，那么大量遗传组分都会参与这样一个复杂的网络。

miRNA具有通过调节众多的下游基因参与调控多个细胞信号传导通路的生物学特性，使得其具有作为疾病早期预测、肿瘤发生及预后评判的热点潜力工具。miRNA能为我们更好地认识癌症的控制提供一个新的途径。miRNA可能不能控制癌的发生、发展及转移这么重要的变化，但能微调正常细胞生长的组织内平衡。

这种调控网络由在多种水平调控基因组结构及基因表达的miRNA和在RNA水平调控相互作用网络中的蛋白质编码基因构成。在复杂的癌症发生发展过程中，笔者推测新鉴定出来的miRNA与癌细胞的增殖、凋亡、迁移及血管发生的调控机制有着某种重要的关联性。

3 MicroRNA基因表达水平的检测

目前对miRNA的认知还没有那么非常清楚，但有一项生物学特征却是非常明确，那就是具有相当的稳定性。这个特点就说明其可能成为一种新的肿瘤生物学标志物，下面总结了经典的检测手段。

3.1 基因克隆

由于miRNA很小，实验中很容易就丢失了，用一般方法建立的cDNA文库中不含有这种基因片段。针对这个特点，笔者富集序列很小的RNA来建立cDNA文库。构建miRNA的cDNA文库的方法通常有两种，①将所有的RNA通过凝胶电泳分离回收小片段RNA，连上接头、逆转录、进行PCR扩增，将片段克隆到载体，最后对每个克隆进行测定[29]。②分离出小片段RNA，进行多聚腺苷酸化反应，逆转录、再进行鸟苷酸化反应，随后进行扩增和测序[30]，最后通过Northern杂交等予以验证。

3.2 MicroRNA芯片

MicroRNA芯片是一门复杂的技术，它提供了大范围检测miRNA的平台，并且着眼于不同生物样品中的表达有差异的miRNA。microRNA芯片是检测样品中每个miRNA的表达水平的首要方法。但要想从片段小、分子间差别不大的miRNA中分离提取出有一定丰度且高品质的miRNA组分，对芯片的要求是极其严格的，需选择专用的miRNA提取盒。miRNA芯片的优点是可以高通量、快速的、多个miRNA进行检测，缺点是价格昂贵，可重复性差，灵敏度一般。通常用于初筛。

3.3 Northern blot

Northern杂交是RNA检测方法中可靠的和经典的技术，也被广泛的应用于研究miRNA的重要方法。灵敏性高及利用RNA marker来检测小RNA的分子大小是此方法的重要特点。实验流程清晰便捷，主要包括：变性处理后进行的RNA电泳，分离总RNA；将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜；转移前后进行的RNA染色；杂交和放射自显影，最后对图像进行分析。Northern杂交也存在着一些缺点，比如需要的样品量大，检测的范围小，还可能出现错配杂交等问题，不适合大范围的筛选实验。

3.4 实时定量PCR

Real-time PCR是定量检测miRNA的重要方法，在使用Taqman探针法时，可明显提高特异性。主要包括：提取miRNA，然后混合引物，依次要变性，复性，使模板与引物配对，然后反转录为cDNA，最后以cDNA为模板，进行RT-PCR。这种方法的优点其一是样品需量低，其二是灵敏度和特异性都很高，其三是测量范围较宽，但成本较高是它的重要缺点。

3.5 其他方法

还有如液相芯片技术[31]、表面增强拉曼光谱法[32]、原位杂交[33]、Small-target quantitative PCR技术[34]等。这些方法大多数可特异的、高效的进行定性、定量分析。

4 总结和展望

通过针对miRNA在基因功能调控中突出作用的不断深入研究和开发，这能为肿瘤的基础与临床研究提供崭新的思路和平台。纵观所有关研究，miRNA在肿瘤中的研究只能算是初期，miRNA在肿瘤发生发展中的作用及分子机制有待深入研究，包括通过功能学试验明确miRNA在肿瘤发生发展中具体作用、miRNA的靶蛋白或靶基因的确定等；miRNA只是初步用在肿瘤的诊断、临床分期以及临床治疗，尤为重要的是确定miRNA谱或者miRNA在肿瘤中具体表达意义，如何收集标本和具体操作方法也是目前需要研究的内容。因此，要想解决这些问题，我们还有很长一段路要走。只要将以上疑惑彻底弄清，定会帮助我们对肿瘤的发生及发展能进一步了解，而且还能为我们对肿瘤的诊治及预后提供强有力的支持。

[1]Medina PP，Slack FJ.Inhibiting microRNA function in vivo[J].Nat Methods，2009，6（1）：37-38.

[2]Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell，1993，75（5）：843-854.

[3]Lau NC，Lim LP，Weinstein EG，et al.An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans[J].Science，2001，294：858-862.

[4]Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature，2005，435（7043）：834-838.

[5]Lagos QM，Rauhut R，Meyer J，et al.New microRNAs from mouse and human[J].RNA，2003，9，175-179.

[6]Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms：growth，death，fat，atress，and timing[J].Cell，2003，113，673-676.

[7]Michael MZ，O'Connor SM，Young GP，et al.Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia[J].Cancer Res，2003，1：882-891.

[8]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120：15-20.

[9]Meister G，Tuschl T.Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA[J].Nature，2004，431：343-349.

[10]Bannerjee D，Slack F.Control of developmental timing by small temporal RNAs：a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression[J].Bioessays，2002，24：119-129.

[11]Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature，2004，431：350-355.

[12]Poy MN，Eliasson L，Krutzfeldt J，et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion[J].Nature，2004，432：226-230.

[13]Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2999-3004.

[14]Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res，2004，64：3753-3756.

[15]Calin GA，Dunitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down regulation of micro-RNA genes miR15 and miR 16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（15）：524-15，529.

[16]Metzler M，Wilda M，Busch K，et al.High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma[J].Genes Chromosomes Cancer，2004，39：167-169.

[17]He L，Thomson JM，Hemann MT，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene[J].Nature，2005，435：828-833.

[18]Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：2257-2261.

[19]Ozen M，Creighton CJ，Ozdemir M，et al.Widespread deregulation of microRNA expression in human prostate cancer[J].Oncogene，2008，27：1788-1789.

[20]Bartel DP.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions[J].Cell，2009，136：215-233.

[21]Ventura A，Jacks T.MicroRNAs and cancer：short RNAs go a long way[J].Cell，2009，136：586-591.

[22]Graziano M，Antonio R，Francesco F，et al.A MicroRNA Targeting Dicer for Metastasis Control[J].Cell，2010，141：1195-1270.

[23]Olsson T，Piehl F，Swanberg M，et al.Genetic dissection of neurodegeneration and CNS inflammation[J].J Neurol Sci，2005，233：99-108.

[24]Liu CG，Calin GA，Volinia S，et al.MicroRNA expression profiling using microarrays[J].Nat Protoc，2008，3（4）：563-578.

[25]Jiang J，Lee EJ，Gusev Y，et al.Real-time expression profiling of microRNA precursors in human cancer cell lines[J].Nucleic Acids Res，2005，33（17）：5394-5403.

[26]Lee DY，Deng Z，Wang CH，et al.MicroRNA-378 promotes cell survival，tumor growth，and angiogenesis by targeting SuFu and Fus-1 expression[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（51）：20350-20355.

[27]Arora S，Ranade AR，Tran NL，et al.MicroRNA-328 is associated with（non-small）cell lung cancer（NSCLC）brain metastasis and mediates NSCLC migration[J].Int J Cancer，2011：Epub ahead of print.

[28]Chen PY，Manninga H，Slanchev K，et al.The developmental miRNA profiles of zebrafish as determined by small RNA cloning[J].Genes Dev，2005，19：1288-1293.

[29]Ambros V，Lee RC.Identification of microRNAs and other tinynoncoding RNAs by cDNA cloning[J].Methods Mol Biol，2004，265：131-158.

[30]Wang JF，Zhou H，Chen YQ，et al.Identification of 20 microRNAs from Oryza sativa[J].Nucleic Acids Res，2004，32：l688-1695.

[31]孙凯，汪谦.液相芯片技术在小分子RNA检测分析中的应用[J].中华医学杂志，2006，86：1437-143.

[32]Driskell JD，Seto AG，Jones LP，et al.Rapid microRNA（miRNA）detection and classification via surface-enhanced Raman spec-troscopy（SERS）[J].Biosens Bioelectron，2008，24（4）：923-928.

[33]Kloosterman WP，Wienholds E，De Brujin E，et al.In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-modified-oligonucleotide probs[J].Nat Methods，2006，3：27-29.

[34]Duncan DD，Eshoo M，Esau C，et al.A bsolute quantitation of microRNAs with a PCR-based assay[J].Anal Biochem，2006，359：268-270.