慢性脑低灌注大鼠海马组织中IDO的变化1）

张敏慧，韩彦青，李光来，李东芳，裴宇恒

慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion）是神经系统一种常见的病理状态，多项基础与临床研究都显示无论是阿尔兹海默病（AD）还是血管性痴呆（VaD）都存在不同程度的慢性脑低灌注。目前对慢性脑低灌注导致认知与神经功能障碍的机制尚不完全清楚。近年来有报道，炎性免疫反应在痴呆等慢性缺血性脑血管病方面有重要作用。近年发现，在干扰素（IFN－γ）作用下，中枢神经系统星形神经胶质细胞、小胶质细胞都能表达吲哚胺－2，3－双加氧酶（indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO），在中枢神经系统疾病中起着重要作用［1］。

本实验采用永久性双侧颈总动脉结扎术模型（2VO）模拟慢性低灌注状态，用Morris水迷宫检测2VO大鼠空间学习与记忆能力变化，通过观察大鼠海马IFN－γ、IDO的表达，探讨IDO在慢性脑低灌注导致认知功能损害炎性发病机制中的作用。

1 材料与方法

1．1 动物 成年健康雄性 Wistar大鼠36只，体质量（203．8±7．8）g，由山西医科大学动物中心提供，在具有通风设备的动物房内笼养，在实验前后过程中均给予充足的水及食物。随机分成假手术组与模型组，各18只。

1．2 动物模型的制备 参照 Wakita等［2］的方法进行2VO模型制备。大鼠于术前12h禁食，4h禁水。10%水合氯醛（350 mg／kg体重）腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，用4号手术线行双重结扎。术后缝合切口并连续3d肌肉注射2×105U青霉素钠，放回笼中保温（26℃）饲养。对照组处理步骤同上，但不进行颈总动脉结扎。在整个实验过程中。模型组大鼠死亡3只，假手术组大鼠全部存活。

1．3 Morris水迷宫行为学测试 动物模型制备4周后行水迷宫测试，实验参照Vorhees等［3］总结的方法进行，主要包括定位航行实验和空间探索实验2个部分。定位航行实验：连续训练5d，每天上午、下午2个时段，每个时段训练3次，分别从3个象限入水。发现平台后，让其在平台上站立30s，将大鼠从平台上拿下来休息60s，再随机由下一象限入水进行试验，如果120 s内找不到平台，则由操作者帮助其上平台，潜伏期记为最高分120s。记录大鼠找到平台的时间（逃避潜伏期）。每天计算其平均数。空间探索实验：用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的保持能力，定位航行实验后，即在第6天上午，撤除水下平台，取任意1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，测定其120s内在平台象限的游泳距离占总距离的百分比（distance percentage，DP）。

1．4 取海马 各组大鼠行为观察结束后，将大鼠麻醉后断头处死，迅速剥离脑组织，沿视交叉前端作冠状切面，立即在冰盒上无菌分离出海马组织，置－70℃冰箱／10%多聚甲醛中备用。

1．5 IDO的检测 海马组织和生理盐水1∶9比例冰上匀浆，将海马研磨成匀浆，3 500r／min离心10min，取上清液。试验中采用IDO试剂盒检测，采用比色法在酶标板上反应。设标准管8管，第1管加蒸馏水950μL，第2～8管加入蒸馏水500 μL，在第1管中加入100ng／mL的标准品溶液50μL，混匀后加样器吸出500μL，移至第2管，如此反复作对倍稀释，从第7管中吸出500μL弃出，第8管为空白对照。每孔加入标准品或待测样品20μL。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗处反应15min。每孔加入100μL终止液混匀。标准品和样品中的IDO与底物工作液显色30min内用酶标仪在450nm处测吸光值（OD）。IDO浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中IDO浓度。

1．6 免疫组织化学法 观察INF－γ的表达：大鼠海马组织经4℃的4%多聚甲醛72h充分固定后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备厚4μm组织切片。切片经脱蜡至水化，3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水冲洗；枸橼酸盐缓冲液，微波热修复20min，PBS洗涤；5%BSA封闭20min，倾去；滴加适当稀释的一抗4℃过夜，PBS缓冲液洗涤；滴加兔抗大鼠二抗37℃反应30min，PBS缓冲液洗涤；滴加试剂SABC，PBS洗涤；DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素－伊红复染，脱水，透明，封片。选取海马区CA1区，将切片在OLYMPUS BX51正置荧光显微镜下观察，采用Image－Pro plus图像处理系统进行分析，以阳性细胞的平均光密度值表示IFN的表达水平。免疫组化染色结果判定：胞浆呈棕黄色为阳性细胞。

1．7 统计学处理 所有数据采用SPSS17．0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 Morris水迷宫行为学测试 实验结果显示，2VO大鼠空间学习及记忆能力下降。水迷宫结果：与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长，平台象限游泳距离百分比减少（P＜0．05）；随着训练天数的增加，两组大鼠的学习能力均有提高，但模型组逃避潜伏期仍长于假手术组（P＜0．05）。详见表1、表2。

表1 两组大鼠每天平均逃避潜伏期测试结果（±s） s

表1 两组大鼠每天平均逃避潜伏期测试结果（±s） s

组别 鼠数 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手术组 18 96．11±2．58 77．49±1．72 52．94±1．24 24．13±1．38 13．88±0．83模型组 15 103．16±2．37 90．94±2．06 71．02±2．021） 42．33±1．491） 30．99±1．831）与假手术组比较，1）P＜0．05

表2 两组大鼠空间探索实验平台象限游泳距离百分比比较（±s） %

表2 两组大鼠空间探索实验平台象限游泳距离百分比比较（±s） %

组别 鼠数 游泳距离假手术组 18 50．51±4．01模型组 15 24．80±3．061）与假手术组比较，1）P＜0．05

2．2 海马INF－γ、IDO的表达 模型组海马组织IDO表达、INF－γ阳性细胞累计光密度值高于假手术组（P＜0．05）。详见表3。

表3 各组大鼠海马CA1区IFN－γ平均光密度值、IDO的表达比较（±s）

表3 各组大鼠海马CA1区IFN－γ平均光密度值、IDO的表达比较（±s）

组别 鼠数 IFN－γ IDO浓度（ng／mL）假手术组 18 0．14±0．04 0．89±0．06模型组 15 0．50±0．031） 4．73±0．211）与假手术组比较，1）P＜0．05

3 讨 论

慢性脑缺血是各种原因引发的长期慢性脑血流灌注不足导致的以持久或进展性认知功能障碍为主要表现的一组疾病，是血管性痴呆、Alzheimer病、Binswanger病等多种疾病的共同病理基础，主要的损伤机制有凋亡、免疫炎性损伤、氧化应激损伤、突触结构和功能异常、能量代谢障碍、中枢胆碱能及单胺能系统神经递质功能紊乱等［4］。本实验动物模型采用较为常用的双侧颈总动脉永久性结扎，保证鼠脑不完全性缺血，与人类慢性脑低灌注相似。通过水迷宫试验证实了模型大鼠存在学习和记忆功能障碍。

吲哚胺－2，3－双加氧酶是IFN－γ诱导表达在抗原提呈细胞、上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞以及中枢神经系统的小胶质细胞等细胞内的一种酶。参与许多疾病的免疫调节，如自身免疫反应性疾病、肿瘤的免疫逃避以及移植免疫。研究证实，正常生理条件下IDO活性很低。当在病毒细菌感染、炎性反应刺激的条件下，IFN－γ分泌增加，可刺激IDO表达增强，IDO诱导产生的毒性化合物是AD发病机制中的重要成分［5］。Gold等［6］认为卒中后认知障碍炎症反应的特点是IDO与犬尿氨酸代谢产物增加。本实验结果显示，模型组大鼠IFN－γ增高，说明慢性脑灌注大鼠的病理生理过程包含着炎性反应，而炎性反应的发生很可能刺激了IDO的高表达。

本实验结果显示，模型组大鼠IFN－γ增高，说明慢性脑灌注大鼠的病理生理过程包含着炎性反应，炎性反应的发生刺激了IDO的高表达，导致神经元损伤、死亡。这可能为使用IDO抑制剂抑制致炎细胞因子产生，从而减轻脑微血管免疫炎症，将为预防和治疗VCI提供新思路。

［1］Godin－Ethier J，Hanafi LA．Indoleamine 2，3－dioxygenase expression in human cancers：Clinical and immunologic perspectives［J］．Clin Cancer Res，2011，17（22）：6985－6991．

［2］Wakita H，Tomimoto H，Akiguehi I．Protective effect of cyclosporin a on white matter changes in the rat brain after chronic cerebral hypoperfusion［J］．Stroke，1995，26（8）：1415－1422．

［3］Vorhees CV，Williams MT．Morris water maze：Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］．Nat Protoc，2006，1：848－858．

［4］刘晖，章军建，杨英，等．慢性脑低灌注对大鼠皮层核因子E2相关因子2表达的影响［J］．中华神经医学杂志，2011，10（1）：6－9．

［5］Bonda DJ，Mailankot M，Stone JG．Indoleamine 2，3－dioxygenase and 3－hydroxykynurenine modifications are found in the neuropathology of Alzheimer’s disease［J］．Redox Rep，2010，15（4）：161－168．

［6］Gold AB，Herrmann N，Swardfager W，et al．The relationship between indoleamine 2，3－dioxygenase activity and post－stroke cognitive impairment［J］．Neuroinflammation，2011，2（16）：8－17．