副溶血弧菌TDH单克隆抗体的研制与性质鉴定①

杨靖亚 陆晓帆 张 建 孙晓红 晁若瑜 钱媛华 (上海海洋大学食品学院，上海201306)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，其广泛分布于全世界的沿海岸及海水中，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品中［1］。近年来副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为世界各地由于食用了生的或未加工成熟的海产品而引起的食源性疾病的主要致病因素［2-7］，大多数现腹泻、腹痛、恶心、呕吐等反应，少数表现出头痛、头晕、发烧等临床症状［1］。目前研究显示，副溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素和尿素酶，分别有不耐热溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)、耐热直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)、直接溶血相关毒素(TDH-related hemolysin，TRH)，其中耐热直接溶血毒素TDH是主要的致病因子［8］。在临床分离菌株中大多表现为TDH+株，而TRH+株为10% ～15%，少数副溶血弧菌具有TDH和 TRH双阳性，环境中分离菌株几乎无TDH［9，10］。该菌的血清分型 O 抗原为13型，K 抗原为71型，其中已知与人胃肠炎有关的O与K的组合有 75 种［11］。

本文以实验室自己制备的高纯度TDH毒素蛋白作为免疫原免疫小鼠，旨在筛选制得高效、特异性强的副溶血弧菌TDH的单克隆抗体，并对其进行生物学特性分析鉴定，以期为建立针对TDH的免疫学检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 致病性副溶血弧菌ATCC33846(标准菌株)购于北京中原公司;沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌F188(从南美白对虾分离出，只含TLH不含TDH，通过生理生化试验和PCR分析，确定为非致病性副溶血弧菌)菌株均由上海海洋大学食品安全实验室惠赠;6至8周龄清洁级雌性BALB/c小鼠购于上海西普尔-必凯动物实验中心;SP2/0细胞由上海海洋大学食品安全实验室惠赠。

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记二抗、纯品小鼠 IgG、OPD 底物、PEG1500、HAT、HT 选择培养基、抗体类型试剂盒、Mineral oil、HiTrap Protein G HP、PD-10 Desalting Columns均购于 Sigma公司;BSA(牛血清蛋白)购于上海正极生物有限公司;RPMI1640、胎牛血清均购于上海普飞生物有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫原的制备 37℃条件下对致病性副溶血弧菌ACTT33846进行摇床扩大培养16小时，8 000 r/min离心取上清去掉菌体，硫酸铵盐析提取粗蛋白，然后依次经过DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖 G-75 层析纯化 TDH［12］，冷冻干燥纯化后的TDH，准确称量，溶解于少量pH7.4 0.01 mol/L的PBS中。

1.2.1.1TDH溶血活性及耐热性测定 静脉取新鲜兔血0.43 ml与20.0 ml的PBS(+)混合制作红细胞悬液。在V形96孔板中预先每孔加入100 μl红细胞悬液后分别再加入20 μl 2 mg/ml纯TDH和20 μl 2 mg/ml经过100℃水浴10分钟热处理的纯TDH，之后将V形96孔板放入恒温培养箱在37℃条件下反应24小时后，观察结果。

1.2.1.2TDH变性温度测定 利用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry，DSC)来测量TDH的变性温度。TDH检测用量为4.500 0 mg，温度设定范围为25℃ ～125℃，时间为10分钟［13］。

1.2.2免疫动物 同时免疫4只8周龄雌性BALB/c小鼠，取纯化后的TDH 10 μg与弗氏完全佐剂充分混合乳化后，通过腹腔注射进行首次免疫，分别于3周后取5 μg TDH与弗氏不完全佐剂混合乳化进行第2次和第3次免疫，每次间隔2周。在第3次免疫之后，对小鼠尾静脉采血，利用间接ELISA法测其血清效价，选取最佳免疫小鼠，当效价达到1∶10 000以上即可最后的加强免疫，三天之后分离脾脏细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合。

1.2.3细胞融合 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的比例混合在一起，在50 ml离心管中用无血清不完全培养液RPMI1640清洗并以1 000 r/min离心8分钟;随后弃去上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动;接着在37℃水浴作用下，加入1.0 ml PEG1500溶液;90秒后加入25 ml 37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用;最后以1 000 r/min离心6分钟，选用含15%胎牛血清HAT选择培养液重悬，以每孔100 μl加到已有饲养细胞层的96孔板内，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养。融合7～10天换用HT选择培养液、20天后使用含15%胎牛血清的RPMI1640普通培养基。

1.2.3杂交瘤细胞的筛选与克隆 用抗原 1 μg TDH/孔包被96孔板，待测细胞上清液为一抗，采用间接ELISA检测筛选阳性杂交瘤细胞，选择阳性孔并用有限稀释法进行3次亚克隆，当克隆孔的阳性率为100%即可，最终挑选出稳定分泌高特异性、高效价、高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，扩大培养并保存于液氮中。

1.2.4腹水制备及纯化 选择8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml液体石蜡，7～10天后再次腹腔注射1×106个杂交瘤细胞于每个小鼠体内，约5～7天便可收集腹水;采用饱和硫酸铵法和HiTrap Protain G亲和层析柱纯化抗体，最终PD-10 Desalting Columns去除小分子物质，并运用间接ELISA进行效价测定和SDS-PAGE分析。

1.2.5单克隆抗体特异性鉴定 在37℃180 r/min恒定条件下，对沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188菌株进行液体增菌摇床培养24小时后，对所有菌液进行8 000 r/min离心10分钟，并取各菌株对应上清液100 μl包被酶标板(每个样品做3个复孔)，用PBS作空白对照，4℃孵育12小时。洗涤后，用封闭液封闭ELISA板(37℃ 120分钟)。洗涤后，加入被检测杂交瘤细胞上清液，0.1 ml/孔，37℃孵育1小时。洗涤后，加入HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，0.1 ml/孔，37℃孵育1小时。洗涤后，加入底物(OPD)溶液，0.1 ml/孔，室温避光显色20分钟。2 mol/L硫酸终止反应后，测定各孔495 nm的OD值。以检测孔与空白对照孔OD值的比值大于2.1(P/N≥2.1)为阳性结果。

因此，通过间接ELISA法检测T9H4单克隆抗体与不同菌株培养离心后上清液中菌株分泌物的反应，从而评价T9H4单克隆抗体的特异性。

1.2.6单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定 取杂交瘤细胞培养上清液，按照 Sigma公司的鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行。

1.2.7单克隆抗体亲和力的测定 ELISA双抗体夹心法确定杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体的浓度：取适宜浓度的纯化兔抗鼠IgG抗体包被酶标板，0.1 ml/孔，4℃过夜。洗涤后，用封闭液封闭ELISA板(37℃120分钟)。加入被检杂交瘤细胞上清液和系列稀释的小鼠的IgG纯品，0.1 ml/孔，37℃孵育1小时。洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，0.1 ml/孔，37℃孵育1小时。洗涤后，加入底物(OPD)溶液，0.1 ml/孔，室温避光显色20分钟。2 mol/L硫酸终止反应后，测定各孔495 nm的OD值。最后以小鼠IgG纯品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘出标准曲线。根据检测杂交瘤细胞培养上清液的OD值，确定其中mAb的准确浓度。

杂交瘤细胞培养上清液中mAb的亲和常数测定(ELISA 间接法)：分别取 50、100、200 μg/ml三种倍比稀释的TDH抗原包被酶标板，0.1 ml/孔，4℃过夜。洗涤后，用封闭液封闭微板(37℃ 120分钟)。洗涤后，加入系列稀释的已知浓度的被检杂交瘤细胞培养上清液，0.1 ml/孔，37℃孵育1小时。洗涤后，加入工作浓度的HRP标记兔抗鼠IgG抗体，0.1 ml/孔，37℃孵育1小时。洗涤后，加入底物(OPD)溶液，0.1 ml/孔，室温避光显色20分钟。2 mol/L硫酸终止反应后，测定各孔在495 nm的OD值。以被检样品不同浓度为横坐标，以其相应OD值为纵坐标，绘制出3条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100%，查出其OD值为50%时点的mAb浓度。

按照下列公式计算亲和常数K值：Ka=(n-1)/2(n［Ab’］t-［Ab］t)。其中 n=［Ag’］t/［Ag］t，［Ag’］t 和［Ag］t为不同包被抗原的浓度，［Ab’］t、［Ab］t是对应不同包被抗原的浓度下，将抗体梯度稀释得到最大吸光度一半处的抗体浓度(mol/L)［14，15］。

1.2.8杂交瘤细胞的稳定性 将单抗细胞按照常规方法冻存与复苏，稳定传代，取细胞上清间接ELISA方法进行效价测定。

1.3统计学分析 采用ANOVA分析方法对同组中不同数据间进行统计学显著性评价(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。

2 结果

2.1TDH溶血活性鉴定 经37℃ 24小时恒温培养后，纯化所得TDH对于兔子红细胞表现出明显的溶血活性(图1)，体现了该毒素的溶血和耐热性特性，与已报道文献［16］相符合。

2.2TDH变性温度测定 DSC结果显示整条曲线只有一个波峰，表明经过三次层析后的TDH的纯度较高，并且测得TDH的变性温度为94.17℃(图2)，体现了该毒素的耐热稳定特性。

2.3杂交瘤细胞株的建立 TDH分子量为46 kD，具有较强的免疫原性，经过五次免疫，2号和3号小鼠都得到比较高的效价，其中2号和3号小鼠效价都达到1∶40 000以上，选择其脾细胞进行了细胞融合。免疫接种小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经选择性培养基培养和间接ELISA筛选，并通过3次亚克隆后得到1株能稳定分泌抗TDH高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为T9H4。

2.4单克隆抗体的效价测定 间接ELISA法分别测定了细胞上清液、腹水中和纯化后的T9H4单克隆抗体效价(表1);经连续传代和-80℃冻存6个月后复苏的杂交瘤细胞仍能稳定分泌抗体，间接ELISA检测的细胞上清液效价和最初没有差别，表明杂交瘤细胞能够稳定地分泌抗TDH单克隆抗体。

图1 溶血活性及耐热性的测定Fig.1 Determination of hemolytic activity and thermostability

图2 TDH的DSC曲线Fig.2 Curve of TDH with Differential Scanning Calorimetry

2.5单克隆抗体轻链、重链分子量 T9H4单克隆抗体经饱和硫酸铵、HiTrap Protain G亲和层析柱纯化后SDS-PAGE电泳条带较纯化前腹水电泳条带明显减少，纯化效果良好。同时SDS-PAGE电泳(图3)显示两条单一目的条带，即分别为T9H4单克隆抗体的重链50 kD和轻链23 kD，可知T9H4单克隆抗体分子质量约为146 kD。

2.6单克隆抗体特异性鉴定 间接ELISA结果表明，单克隆抗体(杂交瘤细胞上清液)只与TDH的反应时呈现阳性值，而与其他菌株的上清液分泌物中反应时均呈现阴性值，即不发生交叉反应，故由此判断T9H4单克隆抗体具有良好的特异性(图4)。

表1 TDH单克隆抗体效价测定Tab.1 The titers of monoclonal antibody against TDH

图3 小鼠腹水纯化电泳图Fig.3 SDS-PAGE figure for purification of ascites from mice

图4 TDH单克隆抗体特异性分析(间接ELISA法)Fig.4 The analysis of TDH monoclonal antibody specificity(indirect ELISA)

图5 小鼠IgG浓度标准曲线Fig.5 Concentration standard curve of IgG

图6 TDH单克隆抗体亲和力曲线Fig.6 The curve of monoclonal antibody against TDH

2.7单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定 利用鼠源单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒检测T9H4单克隆抗体蛋白亚型为IgG1，轻链属Kappa型。

2.8单克隆抗体亲和力的测定 抗体亲和力的测定(非竞争性ELISA方法)：双抗体夹心方法测得小鼠IgG纯品浓度的标准曲线(图5)，根据此曲线得到单克隆细胞培养上清液中的抗体浓度为0.061 0 mg/ml;对单克隆抗体T9H4进行了竞争性测定，分别用20、10和5 μg不同含量的纯TDH抗原包被96孔板，根据3条单克隆抗体相对亲和力曲线(图6)并运用公式 Ka=(n-1)/2(n［Ab’］t-［Ab］t)计算 3 条曲线的Ka值，最终以平均值计为该抗体的亲和性常数，Ka=2.19 ×109L/mol。

3 讨论

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH作为最主要的致病因子，对于广大热衷于海产品的民众的食品安全卫生而言直接产生了相当大的负面作用，因此制备出特异性针对TDH的单克隆抗体有助于开发免疫学快速检测方法。

本文首先提取纯化了纯度为95%以上的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH作为免疫源，通过小鼠腹腔先后进行5次免疫，运用常规间接ELISA法筛选杂交瘤细胞，采取有限稀释法进行细胞亚克隆，最终获得一株针对副溶血弧菌TDH高特异性、亲和力、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株T9H4。整个单克隆抗体的免疫制备过程，我们尽可能提高细胞融合率，用8-氮杂鸟嘌呤处理SP2/0细胞，并调整好骨髓瘤细胞的状态，必要时可以采用通过注射到小鼠体内，使其生长出实体瘤，然后再收集瘤细胞;同时在提取脾细胞时，必须将小鼠脾脏周围的结缔组织完全去除，减少其在融合后对杂交瘤细胞的生长影响与筛选的阻碍作用;除此之外，我们还额外增加了克隆的板数，以期更大可能地获得目的抗体。

此外，我们对于TDH单克隆抗体进行了初步鉴定。纯化后的T9H4抗体效价高达1∶1 024 000;SDS-PAGE分析显示其分子量约为146 kD，重链和轻链分别为50 kD和23 kD;其蛋白亚型属于IgG1、轻链为Kappa型;均不与沙门氏菌、大肠杆菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌(无TDH，含TLH)发生交叉反应，表现出较强的特异性，并伴随有较高的亲和力常数K=2.19×109L/mol，同时杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性也相当良好。

目前，国内尚无有关副溶血弧菌TDH单克隆抗体制备的报道，因此本文着力制备并分析了TDH单克隆抗体特性，为之后更深入的研究提供了重要的实验材料与理论基础。

1 Joseph S W，Colwell R R，Kaper J B.Vibrio parahaemolyticus and relatedhalophilic Vibrios［J］.Crit Rev in Microbiol，1982;10(1)：77-

124.

2 刘秀梅.食源性疾病监控技术的研究［J］.中国食品卫生杂志，2004;16(1)：3-9.

3 Bag P K，Nandi S，Bhadra R K et al.Clonal diversity among recently emerged strains of Vibrio parahaemolyticus O3：K6 associated with pandemic spread［J］.Clin Microbiol，1999;37(7)：2354-2357.

4 DePaola A，Kaysner C A，Bowers J et al.Environmental investigations of V.parahaemolyticus in Oysters after outbreaks in Washington，Texas，and New York［J］.Appl Environ Microbiol，2000;66(11)：4649-

4654.

5 Matsumoto C，Okuda J，Ishibashi M et al.Pandemic spread of an O3：K6 clone of Vibrio parahaemolyticus and emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS sequence analyses［J］.J Clin Microbiol，2000;38(2)：578-585.

6 Okuda J，Ishibashi M，Hayakawa E et al.Emergence of a unique O3：K6 clone of Vibrio parahaemolyticus in Calcutta，India，and isolation of strains from the same clonal groupfrom southeastern Asian travelers arriving in Japan［J］.J Clin Microbiol，1997;35(12)：3150-3155.

7 Ottaviani D，Santarelli S，Bacchiocchi S L et al.Presence of pathogenic Vibrio parahaemolyticus strains in mussels from the Adriatic Sea，Italy［J］.Food Microbiol，2005;22(6)：585-590.

8 吴振龙，聂 军，鲍慧宁 et al.副溶血性弧菌直接溶血毒素基因原核表达载体的构建［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2000;20(4)：573-577.

9 Iida T，Park K S，Suthienkul O et al.Close proximity of tdh，trh and ure genes on the chromosone of vibrio parahaemolyticus［J］.Microbiology，1998;144(9)：2517-2524.

10 Bej A K，Patterson，Brasher C W et al.Detection of total and hemolysion—producing Vibrio parahaemolyticus in selfish using mutiplex PCR amplication of tlh，tdh and trh［J］.J Microbiol Methods，1999;36(3)：215-220.

11 何 晖，邓庆丽，李秀珍et al.检测水产品食物中副溶血弧菌基因分型方法的建立［J］.热带医学杂志，2007;7(11)：1085-

1087.

12 Honda T，Taga S，Takeda T et al.Identification of lethal toxin with the thermostable direct hemolysin produced by Vibrio parahaemolyticus，and some physicochemical properties of the purified toxin［J］.Infect Immun，1976;13(1)：133-139.

13 黄晓毅，韩剑众，王彦波.差示扫描量热技术DSC在肉类研究中的应用进展［J］.食品工业科技，2009;30(6)：353-356.

14 王 宇，沈玉栋，徐振林 et al.氟甲喹单克隆抗体制备、鉴定及间接竞争酶联免疫吸附分析法［J］.分析化学研究报告，2010;3(3)：313-317.

15 柳忠辉，吴雄文，丁天兵 et al.医学免疫学实验技术［M］.北京：人民卫生出版社，2008：23-24.

16 杨振泉，焦新安.副溶血弧菌毒力因子及其致病机理研究进展［J］. 中国人兽共患病学报，2008;24(11)：1070-1071.