肺炎链球菌溶血素经死亡受体/Fas途径和线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡①

董姗姗 王 虹 贺 潇 李忱伟 董 杰 姜 慧 袁 军 何於娟 李岱容

(重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016)

肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)是肺炎链球菌的重要毒力因子，是一种氨基酸序列高度保守的52 kD的可溶性蛋白。Ply是胆固醇依赖的溶细胞素家族成员，在靶细胞膜上通过寡聚体化而形成一种大的环形穿膜孔，所形成的寡聚物与毒素的溶细胞活性以及过度的细胞调节活动有关［1］。在肺炎链球菌与宿主细胞的相互作用中，肺炎链球菌所释放的Ply可直接杀伤靶细胞或导致靶细胞凋亡。

固有免疫是生物在长期进化中逐渐形成的，是机体抵御病原体入侵的第一道防线。细胞凋亡是宿主对病原菌产生固有免疫反应的表现之一，已有研究表明，在肺炎链球菌引起的脑膜炎模型中，溶血素可以诱导神经元细胞和小神经胶质细胞的凋亡，从而加重对宿主的损害。树突状细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞等是主要的固有免疫细胞。目前大多数研究主要针对Ply诱导树突状细胞、耳蜗毛细胞及神经元细胞凋亡及死亡［2-4］，而Ply对小鼠单核巨噬细胞增殖和凋亡的研究鲜有报道。本文通过研究Ply对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7细胞体外生长的影响，探讨Ply诱导单核巨噬细胞凋亡的机制，为进一步研究Ply触发宿主瞬时和早期固有免疫应答机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7购自中国科学院上海细胞生物学研究所;纯化的Ply蛋白由本实验室表达［5］;DMEM培养基，胎牛血清均为美国Hyclone公司产品;二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)均为美国Sigma公司产品;Annexin V/FITC试剂盒、Caspase试剂盒购自Biovision公司;Bax、Bcl-2、Fas多克隆抗体、即用型免疫组化SABC试剂盒、盐酸二氨基联苯胺(DAB)显色试剂购自武汉博士德生物工程有限公司;苏木素染液购自上海如吉生物科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)中，37℃，相对湿度95%，5%CO2培养箱中培养，每2～3天传代一次，注意观察细胞生长状态，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2细胞形态观察 将对数生长期的RAW264.7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成密度为1×105个/ml的单细胞悬液，取5 ml接种于培养瓶中，待贴壁后，加入1 μg/ml Ply蛋白，培养24小时后，倒置显微镜观察细胞形态变化。

1.2.3MTT增殖实验 取对数生长期RAW264.7细胞配制成密度为1×104个/ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔加200 μl，常规培养24小时待细胞贴壁后加入不同浓度Ply蛋白(终浓度为0.1、0.5、1、2.5、5 μg/ml)，另设加入等量培养液的对照组，每个实验组做5个重复孔。分别培养24、48、72、96小时后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃继续培养4小时，用1 ml注射器吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl DMSO，振荡使结晶溶解后，用酶标仪测定不同作用时间下细胞的吸光度(A492)，实验重复5次，计算Ply对细胞生长的影响。细胞增殖 抑 制 率 (%) =(1-A药物/A对照) ×100%。IC50=e{lg最大剂量-［lg(最大剂量/相邻剂量)］［阳性反应率之和-(3-最大阳性反应率-最小阳性反应率)/4］}。

1.2.4Annexin V-FITC/PI双标法检测凋亡细胞百分率 以0.25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞，制成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为1×106个/ml，接种于 6 孔板，设阴性对照组，0.5 μg/ml和 1 μg/ml Ply蛋白组，贴壁后加入相应蛋白，置于37℃、5%CO2孵育1小时和3小时后收集各组细胞参照说明书进行操作，Annexin V-FITC和PI双染后流式细胞仪检测。

1.2.5分光光度法对Caspase-3、8、9进行活性检测 收集 1 μg/ml Ply蛋白作用 24小时后的RAW264.7细胞，PBS洗2次，加入50 μl Lysis Butter和0.5 μl DTT，置冰上作用40分钟，离心收集上清液，加入 50 μl 2 × Reaction Butter和 0.5 μl DTT，再分别加入5 μl Caspase-3、8、9底物，37 ℃避光孵育4小时，用酶标仪测定405 nm波长下的吸光度值(A405nm)，通过与标准曲线对比，得到各组的Caspase-3、8、9 相对酶活力单位。

1.2.6免疫细胞化学法检测Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达 收集1 μg/ml Ply蛋白作用24小时后的RAW264.7细胞，PBS洗涤3遍;4%多聚甲醛25℃固定细胞爬片30分钟，加入新鲜配制的3%H2O2，室温孵育10分钟，PBS洗3遍，每次2分钟;滴加5%BSA封闭液，室温封闭30分钟，甩去多余液体;滴加1∶200稀释的 Bax、Bcl-2、Fas抗体，同时用 PBS代替一抗做阴性对照，4℃过夜;37℃孵育1小时，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30分钟，PBS洗3遍，每次2分钟;滴加试剂SABC，37℃孵育20分钟，PBS洗3遍，每次2分钟;DAB显色，滴加100 μl新鲜配制的DAB显色工作液，室温显色3～10分钟，显微镜下控制反应时间，使用蒸馏水终止显色;苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片;晾干后，显微镜下观察，以胞质和(或)胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。Nikon 80i显微镜计算机图像分析软件key-NIS-Elimements BR3.2选取10个高倍视野(×400倍)，计算每个视野阳性细胞的光密度值及平均光密度值，并计算比值：比值=处理组平均光密度值/对照组平均光密度值，比值反映蛋白 Bax、Fas、Bcl-2表达水平的高低。

1.3统计学方法 本实验所有数据用±s表示，采用t检验分析，使用SAS8.0统计软件进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1倒置显微镜观察RAW264.7细胞形态改变 用1 μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞24小时后，倒置显微镜下观察细胞形态改变，结果显示，对照组细胞紧密排列，与培养瓶壁牢牢粘附，部分细胞伸出触角;Ply蛋白处理组细胞数量显著减少，大多数细胞未贴壁，部分细胞发生皱缩变小变圆，核质浓缩，细胞增殖明显受抑(图1)。

2.2Ply蛋白抑制 RAW264.7细胞生长 0.1、0.5、1、2.5、5 μg/ml Ply 蛋白分别作用于 RAW264.7细胞后，MTT检测Ply对细胞生长的影响。随着作用时间的延长，对细胞的生长抑制作用逐渐增强，具有明显的时效和量效关系(P＜0.01)，见图2。

2.3流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡率 流式细胞仪分析结果显示，0.5 μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞1小时和3小时的凋亡率分别为25.52%和 40.86%，1 μg/mlPly蛋 白 处 理RAW264.7细胞1小时和3小时的凋亡率分别为32.90%和51.56%，随着Ply蛋白浓度的增加和处理时间的延长，RAW264.7细胞凋亡率逐渐增加，与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)，见图3。

图1 倒置显微镜观察RAW264.7细胞形态改变(×200)Fig.1 Cell morphology changes observed by inverted microscope(×200)

图2 Ply蛋白对RAW264.7细胞增殖的影响Fig.2 Effect of Ply on RAW264.7 proliferation

2.4Caspase-3、8、9 的活性检测 1 μg/ml Ply 蛋白处理RAW264.7细胞24小时，Caspase-3、8、9活性均比对照组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

2.5凋亡相关蛋白 Bax、Fas、Bcl-2的表达 Bax、Fas、Bcl-2蛋白主要定位于细胞浆和细胞膜，阳性染色呈棕黄色颗粒。结果显示，Bax、Fas表达较对照组增强，Bcl-2表达减弱(图5)，图像分析软件key-NIS-Elimements BR3.2打分显示变化有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

图3 不同浓度Ply蛋白作用1小时和3小时后对RAW264.7细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of Ply with different concentrations and different incubation times(1 h and 3 h)on RAW264.7 apoptosis respective

图4 Ply蛋白作用24小时对RAW264.7细胞Caspase活性的影响Fig.4 Effect of Ply on Caspase activity of RAW264.7(24 h)

图5 RAW264.7细胞Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达(×400)Fig.5 Expressions of Bax，Fas and Bcl-2 of RAW264.7(×400)

表1 RAW264.7细胞Bax、Fas、Bcl-2蛋白表达的图像分析Tab.1 Image analysis of Bax，Fas and Bcl-2 proteins expression of RAW264.7

3 讨论

溶血素(Pneumolysin，Ply)是肺炎链球菌一个重要的毒力因子，具有溶细胞活性、补体激活和诱导细胞凋亡等多种生物学功能［1-4］，但其具体在细菌感染宿主的哪些环节发挥作用，目前尚不十分清楚。

凋亡是细胞的一种程序性死亡，在生理情况下是机体组织清除衰老和受损细胞的一种自杀方式，作用在于调节细胞增殖和死亡处于动态平衡状态。但当机体受到细菌等病原体刺激时，凋亡就成为宿主对病原菌产生先天性免疫反应的表现之一。当病原体对机体的刺激达到一定强度，正常细胞凋亡过度，就会对机体造成损害。已有研究表明，在肺炎链球菌引起的脑膜炎模型中，溶血素可以诱导神经元细胞和小神经胶质细胞的凋亡，从而加重对宿主的损害［4］。而肺泡巨噬细胞在小鼠肺部含量非常丰富，并且在小鼠对肺炎链球菌的天然免疫中起着重要的作用。有研究显示Ply可诱导肺泡巨噬细胞凋亡［6］，但其具体分子机制尚不十分清楚。

本研究通过倒置显微镜进行细胞形态观察，显示Ply蛋白处理组细胞呈现出明显的凋亡形态学改变，细胞增殖明显受抑;MTT增殖实验表明不同浓度的Ply蛋白分别作用于RAW264.7细胞后，随着作用时间的延长，对细胞的生长抑制作用逐渐增强，具有明显的时效和量效关系，表明Ply蛋白可以明显抑制RAW264.7细胞的生长;流式细胞仪测定凋亡率也提示随着Ply浓度和处理时间的延长，RAW264.7细胞的凋亡率显著增加;以上结果均证实Ply蛋白在体外可引起RAW264.7细胞的凋亡。

对于哺乳动物来说，细胞凋亡的主要途径有两条：死亡受体/Fas途径和线粒体途径。不管是死亡受体途径还是线粒体途径，都是由Caspase的活化而启动的［7］。

Caspase是一类在凋亡的启动过程中起关键作用的半胱氨酸家族蛋白酶，其中Caspase-8介导死亡受体/Fas途径;Fas蛋白是肿瘤坏死因子受体超家族成员，它主要是与FasL蛋白结合激活Caspase-8，引起细胞凋亡，这一通路即为死亡受体途径［7-9］。Caspase-9介导线粒体途径，Bcl-2家族蛋白主要调控线粒体途径，包括促进凋亡的Bax等蛋白和抑制凋亡的 Bcl-2等蛋白［10-12］。Caspase-3是Caspase-8和Caspase-9共同的下游分子。

RAW264.7细胞的溶血素蛋白处理组与对照组相比，处理组细胞的 Caspase-3、8、9活性均增高，Bax、Fas表达增高，Bcl-2表达降低。Caspase-8与Fas表达增高，提示Ply诱导RAW264.7细胞凋亡有经过Fas途径;Caspase-9与Bax表达增高，Bcl-2表达降低，说明也有线粒体途径的激活。两条途径的激活都使得下游分子Caspase-3表达升高。因此我们认为死亡受体/Fas途径和线粒体途径共同参与了Ply诱导的RAW264.7细胞凋亡。

综上所述，Ply可以诱导RAW264.7细胞的凋亡，诱导凋亡的机制可能是通过死亡受体/Fas途径和线粒体途径双重机制的介导加以实现，具体机制有待进一步研究。

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