一株草鱼呼肠孤病毒检测用单克隆抗体的制备及其特性①

杨 倩 曹海鹏 和永杏 姜有声 吕利群

(上海海洋大学国家水生动物病原库，上海201306)

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引起的病毒性疾病，传染性强，对草鱼的致死率极高，是危害我国水产养殖业最严重的疾病之一［1］。因此，采用快速有效的手段检测草鱼呼肠孤病毒对诊断草鱼出血病具有重要的意义。鉴此，本实验在制备了对GCRV具有良好中和能力的抗VP7多抗血清的基础上［2］，进一步筛选了最佳分泌外壳蛋白VP7单克隆抗体的杂交瘤细胞，制备了外壳蛋白VP7的单克隆抗体，并对该单克隆抗体的亚型、灵敏度、特异性及临床检测效果等免疫学特性进行了分析，为GCRV的ELISA检测及草鱼出血病的临床诊断奠定了重要的技术基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 草鱼呼肠孤病毒GDV004株，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供;疑似患草鱼出血病的草鱼病样(1～14)，分别于2011年6～8月采集自江西南昌地区和广东广州地区;BALB/c小鼠，购自上海动物实验中心;鼠源性单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒，购于Sigma公司;Bradford蛋白质定量检测试剂，购于生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7单克隆抗体的制备与筛选、亚型鉴定及纯化 参照胡鲲等［3］的方法进行单克隆抗体的制备，然后通过ELISA法筛选能够分泌外壳蛋白VP7单克隆抗体的杂交瘤细胞株(其中OD450值大于0.25且大于阴性对照(NC)值的两倍即为阳性)，并进一步采用GCRV病毒液作为包被原，通过 ELISA法、Western blot法(以含pGEX-4t-3质粒的大肠杆菌及CIK细胞作为阴性对照)筛选出特异性强、检测限低的最佳杂交瘤细胞株［2，3］。采用鼠源单克隆抗体快速检测亚型检测试剂盒对该单克隆抗体进行亚型鉴定，并制备BALB/c小鼠腹水，采用辛酸-饱和硫酸铵法进行单克隆抗体的纯化，采用Bradford蛋白质定量检测试剂测定抗体浓度［4］。

1.3 临床检测效果的测定 参照刘永奎等［5］的方法对疑似患草鱼出血病的草鱼病样进行处理;ELISA法检测草鱼病样阳性(选择 ELISA检测GCRV病毒液后 OD450值为1时的抗体浓度)，以Seng等［6］的RT-PCR法对草鱼病样组织上清过滤液中草鱼呼肠孤病毒的检测结果进行验证。

2 结果

2.1 草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7单克隆抗体的制备与筛选、亚型鉴定及纯化 共筛选12株能够分泌外壳蛋白VP7单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别依次暂命名为MA1～MA12，其中MA3产生的单克隆抗体的效价最高，稀释 8×105倍后的 OD450为1.656，纯化的抗体浓度为3.77×103μg/ml，抗体效价为1∶5 120;对病毒滴度为50 TCID50的GCRV的最低检测限为0.737 μg/ml;能够特异性识别原核表达的外壳蛋白VP7和感染GCRV的CIK细胞中的外壳蛋白VP7，对GST标签蛋白也无特异性反应，且条带清晰、背景无杂带、特异性强(图1);经鼠源单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒亚型鉴定，该抗体亚型为IgG2b。

2.2 草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7单克隆抗体临床检测效果的测定临床试验ELISA及RT-PCR结果见图2。由图可见，ELISA法与RT-PCR法对草鱼病样上清过滤液中草鱼呼肠孤病毒的检测具有一致性。

图1 MA3产生的VP7单克隆抗体的Western blot结果Fig.1 Western blot results of MA3 Mab

图2 ELISA及RT-PCR法对草鱼病样组织上清过滤液中草鱼呼肠孤病毒的检测Fig.2 GCRV detection supernatant filtrates of samples of diseased grass carp orgen samples by ELISA and RT-PCR

3 讨论

单克隆抗体在水产动物病原检测方面已经得到了广泛应用。然而，从现有文献资料来看，国内尚未建立草鱼呼肠孤病毒免疫学检测方法。本实验制备了草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7的单克隆抗体，并分析了其免疫学特性，为今后建立更加灵敏、准确、特异性强的快速检测草鱼呼肠孤病毒方法奠定了坚实的基础。

目前，国内外大多数研究者对草鱼呼肠孤病毒抗血清(抗体)及其特性进行了大量研究。例如，方勤等［7］获得了草鱼呼肠孤病毒GCRV873抗体，证实其能够有效地中和草鱼呼肠孤病毒991病毒颗粒，形成抗原抗体免疫复合物;卲健忠等［8］制备了草鱼呼肠孤病毒的兔GCHV抗血清及鼠GCHV抗血清，其抗体效价分别为1∶256和1∶32，对草鱼呼肠孤病毒检测的灵敏度比SPA-CoA法和常规ELISA法分别提高10倍和20倍。而本实验对草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7的单克隆抗体的检测结果相当于卲健忠等［8］报道的草鱼呼肠孤病毒抗血清抗体效价20倍，这与单克隆抗体具有高度特异性及均质性、含量高且成分单一有关。

随着分子生物学技术的迅速发展，国内已经相继建立了多种草鱼呼肠孤病毒PCR检测方法，并广泛应用于草鱼呼肠孤病毒的常规检测。因此，本实验采用RT-PCR法对草鱼病样上清过滤液中的草鱼呼肠孤病毒进行了检测，以确定基于外壳蛋白VP7单克隆抗体的ELISA法对草鱼呼肠孤病毒检测的特异性与准确性。实验结果表明，基于外壳蛋白VP7单克隆抗体的ELISA法与RT-PCR法对草鱼病样上清过滤液中草鱼呼肠孤病毒的检测结果完全一致，可用于草鱼呼肠孤病毒的常规检测。

1 方 勤，朱作言.水生呼肠孤病毒研究进展［J］.中国病毒学，2003;18(1)：82-88.

2 He Y，Yang Q，Xu H et al.Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protein VP7 and its vaccine potential［J］.African J Microbio Research，2011;5(13)：1643-1648.

3 胡 鲲，黄宣运，姜有声 et al.环丙沙星单克隆抗体的制备及免疫学特性分析［J］.中国免疫学杂志，2010;26(7)：538-543.

4 冯仁青，郭振泉，宓捷波.现代抗体技术及其应用［M］.北京：北京大学出版社，2006：47-50.

5 曾伟伟，王 庆，刘永奎 et al.一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析［J］.水生生物学报，2011;35(5)：790-796.

6 Seng E K，Fang Q，Lama T J et al.Development of a rapid，sensitive and specific diagnostic assay for fish.Aquareovirus based on RT-PCR［J］.J Virolo Meth，2004;118：111-122.

7 方 勤，肖调义，丁清泉 et al.草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV991)的病毒学特性分析［J］.中国病毒学，2002;17(2)：178-181.

8 卲健忠，项黎新，李亚南 et al.应用Dot-ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究［J］. 水产学报，1996;20(1)：6-12.