不同方法 治疗后脓毒症患者的肠道通透性测定及比较*

葛姗姗 吴建浓 朱英 郭鑫艳

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

肠道黏膜通透性（IP）是指肠黏膜上皮容易被某些物质分子以非载体或通道介导的被动扩散方式通过的特性。在病理状态下，肠黏膜屏障功能可能受损，IP增高，肠道内毒素及细菌进入体内，可促进疾病的进展或出现并发症［1-2］。利用不被体内代谢的大分子糖类乳果糖（L）/甘露醇（M）排出比值测定肠黏膜通透性，评估肠黏膜的完整性，是一种无创性诊断肠黏膜屏障功能的方法 。本研究建立高效液相蒸发光散射（HPLCELSD）测定人尿样品中乳果糖和甘露醇含量的方法 ，并对脓毒症患者的IP进行检测。

1 材料

1.1 主要仪器美国Waters公司1525高效液相色谱仪，配备Binary泵、进样器、柱温箱、ELSD2424检测器；色谱柱：Lichroshen NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm江苏汉邦科技有限公司）；数据处理系统。

1.2 试剂乳果糖标准品（中国药品生物制品检定所，批号100057-200601）、甘露醇标准品（中国食品药品鉴定研究院，批号10053-201103），D-402弱酸性阳离子交换树脂（常州华特有限公司）。

2 方法 与结果

2.1 标本采集共18例样品，纳入标准：进入本院ICU病房的脓毒症患者且治疗时间超过72 h者。排除标准：排除肾功能不全、已知IP升高原因（如已知原发性小肠疾病、消化性溃疡、肠系膜缺血或感染性肠道疾病）；前30 d内有使用非甾体类消炎药物的记录；预计要使用甘露醇或乳果糖作为治疗的一部分；及进入其他临床研究者且随机分成常规治疗组和常规治疗结合针灸组各9例。常规治疗组分别为样1～样9，常规治疗结合针灸组分别为样10～样18。各试验对象实验前晚禁食，次日晨排空膀胱后，给予口服或胃管内注入糖探针（乳果糖甘露醇混合液50 mL，含乳果糖10 g，甘露醇5 g），留取口服糖探针6 h内的全部尿液，计量，混匀后取10 mL，滴入2%硫柳汞4滴防腐处理，置零下30℃冰箱保存待检。5 d后再按上述步骤收集尿液。2.2标本预处理取尿样0.8 mL，4℃（12000 r/min）离心30 min；取上清液，并加入约50 mg D-402弱酸性阳离子交换树脂，混旋，离心，将已被吸附离子后的上清液再经孔径为0.22 μm的水系滤膜过滤后，上机检测。

2.3 色谱条件及色谱图柱温室温，流动相：V乙腈︰V水（75︰25）。流速1.1 mL/min，ELSD检测器漂移管温度为60℃。喷雾器：加热，动力60%。气体压力：30 psi。电信号放大系数：2。撞击器：关。在上述色谱条件下，甘露醇和乳果糖标准品溶液，尿样中组分均能实现基线分离，峰形良好。甘露醇和乳果糖的保留时间分别为8.635min和13.7040 min。见图1～图6。

2.4 标准溶液的配制

2.4.1 甘露醇标准溶液的配制及线性关系精密称取甘露醇标准品79.30 mg，用蒸馏水配制成7.93 mg/mL的标准储备液。精密量取甘露醇储备液，分别配制成浓度为39.65、79.3、158.6、317.2、634.4、1268.8、2537.6μg/mL的溶液。取以上7种浓度的甘露醇标准溶液，进样20 μL，以其峰面积的对数值为纵坐标，进样量（μg）的对数值为横坐标做线性回归。结果 表明，甘露醇双对数线性方程为logy=1.2895logx+3.4952（r=0.9995），进样量线性范围为39.65～2537.6 μg/mL。

图1 未给予糖探针空白尿样色谱图

图2 甘露醇和乳果糖标准对照品色谱图

图3 常规组样4第1日尿样图谱

图4 常规组样4第5日尿样图谱

图5 常规治疗结合针灸组样8第1日尿样色谱图

图6 常规治疗结合针灸组样8第5日尿样色谱图

2.4.2 乳果糖标准溶液的配制及线性关系精密称取乳果糖标准品50.01 mg，用蒸馏水配制成5.01 mg/mL的标准储备液。精密量取乳果糖储备液，分别配制成浓度为25.05、50.1、100.2、200.4、400.8、801.6、1603.2 μg/mL的溶液。取以上7种浓度的乳果糖标准溶液，进样20 μL，以其峰面积的对数值为纵坐标，进样量（μg）的对数值为横坐标做线性回归。结果 表明，乳果糖的双对数线性方程为logy=1.0624logx+3.6359（r=0.9993），进样量为25.05～1603.2 μg/mL。

2.5 精密度取一份样品同一日重复进样6次，每次进样20 μL，测定峰面积，计算甘露醇和乳果糖的日内精密度（RSD），结果 分别为1.52%和1.95%。同批样品连续测定6 d，每次进样20 μL，测定峰面积，计算甘露醇和乳果糖的日间精密度（RSD），结果 分别为1.59%和1.37%。结果 表明试验的精密度良好。

2.6 重复性准确量取同一份样品0.8 mL各6份，按2.2项下方法 处理，按2.3色谱条件进行分析，计算甘露醇和乳果糖的含量，结果 甘露醇的平均含量为0.88 mg，RSD为1.04%，乳果糖的平均含量为0.66 mg，RSD为2.56%。

2.7 加样回收率实验将同一患者的6 h尿样中甘露醇和乳果糖排出量测定3次，取平均值为尿样中原糖的含量。准确量取该份样品0.8 mL各9份，加入高中低3个含量的甘露醇和乳果糖标准品，每个含量配制3份，按2.2项处理后按2.3色谱条件进样分析，计算平均回收率，结果 见表1。

表1 甘露醇加样回收率实验测定表

2.8 样品含量测定准确量取各样品0.8 mL按2.2项下方法 制备供试品，按2.3色谱条件进行分析，各样品分别平行测定3份，计算甘露醇和乳果糖的平均含量、RSD和L/M比值，结果 见表3～7。常规治疗组受试者第1日和第5日的L/M测定值分别为（0.920±0.0200）和（0.520±0.170）；常规治疗结合针灸组受试者第1日和第5日的L/M测定值分别为（1.410±0.5200）和（0.770±0.460）。结果 表明不论是常规治疗组还是常规治疗结合针灸组，治疗5 d后尿液中乳果糖含量变化显著，而甘露醇变化甚微。常规治疗组的IP出现了显著变化，而常规治疗结合针灸组的IP出现极显著变化。常规治疗结合针灸组和常规治疗组相比，尿液中乳果糖含量差异较小，但甘露醇变化极显著，IP差异较大。证明常规治疗结合针灸能更好的改善患者的IP。

表2 乳果糖加样回收率实验测定表

表3 常规治疗组第1日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

表4 常规治疗组第5日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

3 讨论

乳果糖和甘露醇在人体肠道内属于被动吸收。在正常情况下，不易被肠道吸收，代谢不活泼，在尿液中含量较小，等量排出，无毒性，不易被机体免疫系统识别。药物无异味，患者能接受。在病理情况下，肠黏膜受损，细胞间的紧密连接处破坏、间隙扩大，通透性增加，通过细胞旁道吸收乳果糖（L），易于穿过，吸收量明显增加，穿过小肠上皮细胞水溶性微孔吸收的甘露醇（M），其吸收量变化甚微，L与M的比值增大。

表5 常规治疗结合针灸组第1日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

表6 常规治疗结合针灸组第5日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

表7 常规治疗组和常规治疗结合针灸组尿中乳果糖和甘露醇排泄率及比值（L/M）表（±s）

表7 常规治疗组和常规治疗结合针灸组尿中乳果糖和甘露醇排泄率及比值（L/M）表（±s）

与常规组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与第1日的尿样比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别第1日第5日常规组L0.067±0.0100.046±0.0140*（n=9）M0.075±0.0130.090±0.0168 L/M0.920±0.0200.520±0.170*针灸组L0.069±0.0120.045±0.015*（n=9）M0.055±0.0200.073±0.025△L/M1.410±0.520△0.770±0.460**△

尿液经低温高速离心和微孔滤膜过滤后，能基本除去尿液中的蛋白质，是比较理想的去蛋白质方法 。但是尿液中还含有一定的离子，需要用弱酸性阳离子交换树脂予以去除。

测定糖类物质，HPLC法中使用的色谱柱有专用糖分析柱NH2柱。专用糖分析柱条件苛刻，本实验使用了NH2改性柱，可以通过改变乙腈与水的比例，使乳果糖和甘露醇的保留时间有所改变，减少流动相中乙腈的量或提高水的比例能使乳果糖和甘露醇的洗脱时间提前。但是会使分离度降低，而且水的比例过大会造成氨基柱的损伤。综合考虑以上因素，当乙腈和水的体积比为75︰25，流速为1.1 mL/min时，分离效果令人满意。

而ELSD是一种新型的通用型质量检测器，几乎对所有样品成分有响应，且对不同化合物的响应差别较小，能检测挥发性比流动相低的任何样品，可以在很大程度上克服HPLC-IR检测方法 的不足。ELSD检测器的参数主要有漂移管温度和载气流速。漂移管温度影响检测器的响应，温度低时流动相蒸发不完全，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比提高，但温度过高会使流动相沸腾，增加背景噪音，还可导致组分部分气化，信号响应值变小，只有温度在流动相基本蒸发完全的基础上，产生可以接受的噪音的最低温度。一般来说，载气流速越小，形成的溶质颗粒越大，散射光的强度越大，但是当载气流速太小时，流动相蒸发不完全，背景噪音大，最优的载气流速影视在产生可接受噪音的基础上，产生最大响应值的最低流速。因此可以选择HPLC-ELSD来测定尿液中甘露醇和乳果糖的含量。通过与正常人的L/M值或者不同方法 治疗前后L/M比值的变化来比较患者的IP，判断治疗方法 对人IP的影响，从而更好的将治疗方法 应用于临床。

［1］ 陈丹，姜春燕，马辰.HPLC-ELSD法测定尿液中甘露醇和乳果糖浓度［J］.感染、炎症、修复，2007，8（2）：79-82.

［2］ 刘放南，谭力，罗楠.高效液相色谱法检测尿乳果糖/甘露醇排出比值及成人正常值［J］.肠外与肠内营养，2004，11（4）：237-238.

［3］ 杨建荣，宋怀宇，姜春华，等.高效液相色谱-蒸发光散射法测定人肠黏膜通透性的方法 学及临床应用研究［J］.广西医学，2009，12（31）：1751-1755.

［4］ 宋怀宇，姜春华，杨建荣，等.液相色谱-蒸发光散射检测法测定人肠黏膜通透性的方法 学研究［J］.临床消化病杂志，2008，20（6）：349-352.