淫羊藿、女贞子配伍激素对哮喘大鼠ET/NO平衡的影响作用*

高健翔 张伟华 刘仁慧△

（1.首都医科大学，北京100069；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437）

中医药防治哮喘具有独特优势，特别是通过中医药对全身的调节作用（神经-内分泌-免疫调节），协同糖皮质激素可以有效缓解副作用。本课题组前期研究发现，淫羊藿女贞子有协同激素抗炎，拮抗激素导致的内源性GC-GR作用受损及保护骨代谢的作用［1-3］。为进一步探讨淫羊藿、女贞子协同激素治疗哮喘的作用途径，本实验在前期研究已建立的哮喘大鼠模型的基础上给予地塞米松干预治疗2周，并同时配合服用淫羊藿、女贞子煎剂，观察淫羊藿女贞子合激素干预治疗对哮喘大鼠ET/NO的影响作用，以期为应用平补阴阳中药协同激素干预哮喘模型提供实验与理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级健康雄性SD大鼠63只，体质量（120±10）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK-（军）2007-004。

1.2 仪器402A超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）、雾化箱（以有机玻璃为材料自制，规格：40×30×20 cm3）、XH6080放免仪（西安核仪厂）、电动匀浆机（上海精密仪器仪表有限公司），721分光光度计（岛津公司）。

1.3 试剂与药物卵清白蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶（美国Sigma公司）；ET-1放免测定盒（北京北方生物技术研究所，批号20120328）；NO测试盒（南京建成生物工程研究所，批号20120328）；NOS试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20120322）；蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号2012.330）。淫羊藿、女贞子（购于北京同仁堂药店）；地塞米松磷酸钠注射液（天津药业焦作有限公司，批号10081711）；阿斯美胶囊（上海三共制药有限公司，批号908020）。

1.4 分组方法 按随机数字表法分为6组，即正常对照组（10只），哮喘模型组（10只），激素干预组（11只），淫羊藿女贞子组（11只），淫羊藿女贞子合激素组（11只），阿斯美组（10只）。

1.5 造模与给药参考文献［4］方法 于实验第1～35日，除正常对照组外，其余动物全部造模。在普通哮喘模型制备成功的基础上，各造模组均每周2次给予1%OVA雾化吸入直至第48日结束。激素干预组、淫羊藿女贞子合激素组每日腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg体质量，连用2周。淫羊藿女贞子组、阿斯美组于实验第36日开始分别灌胃淫羊藿女贞子水溶液（9.5 g/kg体质量）、阿斯美水溶液（25.11 mg/kg体质量），每日1次，直至48 d。淫羊藿女贞子合激素组在激素干预组处理的基础上，于实验35 d开始灌胃淫羊藿女贞子水溶液（9.5 g/kg体质量），每日1次，灌胃至第48日。实验中，淫羊藿女贞子合激素组动物死亡1只。

1.6 标本采集与检测大鼠腹腔麻醉，迅速开胸，取肺组织适量，在冰冷的生理盐水中漂洗，拭干，称重后，以预冷的生理盐水匀浆，制成10%的组织匀浆，离心，取组织匀浆上清分装冻存。（1）肺ET-1：按照试剂盒说明书，采用RIA法检测ET-1含量并同时以测得匀浆上清蛋白含量（g）进行校正。（2）肺组织NO、NOS（分型）：按照试剂盒说明书，均采用分光光度计法检测。

1.7 统计学处理采用SPSS16.0软件包完成。数据采用（x±s）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果 选择LSD（方差齐）或Tamhane’sT2（方差不齐）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织ET-1、NO、ET/NO的比较见表1。与正常对照组比较，哮喘模型组ET-1、NO含量均显著上升（P均＜0.01）；与哮喘模型组比较，激素干预组，淫羊藿女贞子组，淫羊藿女贞子合激素组和阿斯美组的ET-1含量均显著降低（P＜0.05或0.01），仅淫羊藿女贞子合激素组NO含量显著降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠肺组织ET-1、NO水平比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织ET-1、NO水平比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与哮喘模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别nET-1NO（U/L）正常对照组1035.36±11.2851.86±18.63哮喘模型组1081.07±26.60**93.29±22.06**激素干预组1158.22±15.40△△75.32±23.63淫羊藿女贞子组1165.27±19.84△81.90±30.83淫羊藿女贞子合激素组1049.40±15.70△△63.49±25.91△阿斯美组1060.45±14.60△75.26±28.31

2.2 各组大鼠肺组织tNOS，iNOS，cNOS含量比较见表2。哮喘模型组较正常对照组tNOS、iNOS含量显著上升（P＜0.05或0.01）；cNOS含量显著降低（P＜0.01）。与哮喘模型组比较，激素干预组、淫羊藿女贞子组、淫羊藿女贞子合激素组的iNOS含量显著降低（P均＜0.01）；淫羊藿女贞子合激素组、淫羊藿女贞子组cNOS含量显著上升（P均＜0.05）。

表2 各组大鼠肺组织tNOS，iNOS，cNOS含量比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织tNOS，iNOS，cNOS含量比较（±s）

组别ncNOS正常对照组1010.18±3.19哮喘模型组104.93±1.87**激素干预组116.13±1.76 tNOSiNOS 17.27±5.7017.27±5.70 33.25±7.13*28.32±7.36**25.72±5.0519.59±4.77△△淫羊藿女贞子组117.76±2.71△29.08±6.5121.33±5.77△△淫羊藿女贞子合激素组1028.09±5.5220.75±5.76△△7.34±2.44△阿斯美组1029.61±6.4623.11±5.306.50±2.42

2.3 各组大鼠肺组织ET/NO（NOS）的比较见表3。各组之间ET/NO比值均无明显差异。哮喘模型组较正常对照组ET/iNOS、ET/cNOS比值均显著升高（P＜0.05或0.01）；与哮喘模型组比较，激素干预组、淫羊藿女贞子组、淫羊藿女贞子合激素组、阿斯美组的ET/cNOS值均显著降低（P＜0.01）。

表3 各组大鼠肺组织ET/NO（NOS）比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织ET/NO（NOS）比较（±s）

组别nET/cNOS正常对照组103.76±1.84哮喘模型组1020.08±13.68**激素干预组119.90±2.81△△ET/NOET/iNOS 0.70±0.122.12±0.61 0.90±0.312.99±1.03*0.84±0.323.12±1.02淫羊藿女贞子组119.10±3.81△△0.90±0.363.11±0.72淫羊藿女贞子合激素组100.86±0.312.39±0.458.32±6.86△△阿斯美组100.89±0.352.69±0.7410.64±5.27△△

3 讨论

ET是目前所知最强的支气管收缩剂，作用缓慢而持久，有研究指出ET对去上皮的呼吸道收缩作用较上皮完整的呼吸道更强。因此，当呼吸道上皮损伤时，其使呼吸道收缩的作用更明显。目前认为ET的作用机制有：刺激呼吸道肥大细胞释放组胺，促进炎症的释放，从而引起瀑布样炎症反应，并间接使呼吸道收缩；除具有强烈的收缩人体大血管如肺动脉等作用外，对支气管微血管也有直接的收缩作用，使呼吸道黏膜血流和微循环通透性增加，导致呼吸道黏膜充血水肿；促进EOS的浸润；促进平滑肌细胞和成纤维细胞增殖和黏膜下腺体分泌［5］。本实验结果 证实模型大鼠肺组织中ET含量显著升高，提示哮喘模型存在的支气管收缩反应与ET升高有密切关系。各给药组均能明显降低肺组织ET水平，其中以淫羊藿女贞子合激素组作用趋势较佳。提示药物可以通过阻止ET的生成和释放，或抑制其作用，减轻气道炎症及气道重建，降低气道高反应性（AHR），达到控制和预防哮喘的目的 。

大量研究表明NO及NOS在哮喘的发病中起到了重要的作用［6］。众多研究表明，哮喘的发生是包括NO在内的众内源性炎性介质共同作用的结果 。而内源性NO由NOS催化其底物L-精氨酸和氧分子而生成，而合成NO的酶有3种亚型，即内皮型（eNOS）、神经型（nNOS）和诱导型（iNOS），前两者总称为构成型一氧化氮合酶（cNOS）。在生理状态下，cNOS发挥作用，诱导产生低浓度的NO而发生生理效应，如松弛血管及气道平滑肌，神经信号传递及宿主防御功能等，从而在气道平滑肌张力调节和肺部免疫防御等方面发挥重要作用；但在病理状态下，NO生成减少，NANC（非肾上腺素能非胆碱能神经）功能发挥不足，此时iNOS被激活，由其介导产生大量的NO，而局部大量NO可引起气道充血、血浆渗漏，造成肺上皮细胞及组织损伤而诱发气道高反应性，同时局部NO含量的迅速增加可扩张支气管黏膜血管，导致黏膜水肿，通过非肌性机制加重气道阻塞［9］。本研究发现，哮喘大鼠肺组织NO、tNOS、iNOS含量均显著上升，而cNOS含量则显著下降，提示在哮喘发作时，因cNOS抑制而导致其诱导的发挥生理性舒张支气管平滑肌作用的NO生成减少，气道非肾上腺素能非胆碱能神经功能发挥不足，而iNOS活性大大增强导致局部大量NO产生，加重气道组织损害而诱发气道高反应性，与上述研究相符。与哮喘模型组相比，各给药组中仅淫羊藿女贞子合激素组NO含量显著降低；激素干预组、淫羊藿女贞子组、淫羊藿女贞子合激素干预组iNOS含量均显著降低；而淫羊藿女贞子组、淫羊藿女贞子合激素组cNOS含量显著升高。提示糖皮质激素抗炎作用与抑制iNOS的产生有关。有研究表明，地塞米松可使肺组织iNOS mRNA表达量明显减少，且具有剂量相关性，提示糖皮质激素可在转录水平上抑制iNOS的活性，从而减少NO的生成［7］。而激素应用的同时合用中药，不仅可通过下调iNOS水平，抑制iNOS的致炎作用，减少内源性NO生成，减轻气道炎症及气道重建，降低AHR；并通过上调cNOS活性，从而诱导神经源性NO而发挥对气道的舒张作用。

生理状态下ET/NO平衡维持气道基础张力的作用在哮喘发病过程中处于失衡状态。由于哮喘发病中iNOS活性明显增强，诱导大量NO生成，使ET/NO比值无法正确反映ET/NO失衡对AHR的影响［4］。本实验结果 亦证实各给药组对肺组织ET/NO比值均无明显影响。通过相关分析进一步证实：NO与iNOS水平呈高度正相关，而NO与cNOS水平不相关。因cNOS诱导产生的NO为气道内舒张性神经递质，故本实验选择ET/cNOS比值以观察ET/NO失衡的影响作用。实验结果 显示，模型ET/cNOS比值明显增高。而各给药组均对ET/cNOS比值均有明显降低作用，以淫羊藿女贞子合激素组作用趋势较佳，提示激素合用中药后可调节气道局部生ET/NO平衡维持气道基础张力的作用，从而降低气道高反应性。

［1］ 刘仁慧，袁颖，张伟华，等.淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠模型撤停后阶段的影响研究［J］.世界中西医结合杂志，2012，7（7）：563-565.

［2］ 刘仁慧，许利平，王秀娟，等.淫羊藿女贞子合用地塞米松抗哮喘大鼠的研究［J］.中国中药杂志，2012，37（10）：1497-1499.

［3］ 刘仁慧，王秀娟，袁颖，等.淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠骨代谢的影响研究［J］.吉林中医药，2012，32（5）：490-492.

［4］ 刘仁慧，郑君芳，袁颖，等.淫羊藿女贞子配伍调节哮喘大鼠NO/ET及HPA轴作用的研究［J］.中国中药杂志，2010，35（12）：1590-1593.

［5］ Avenier C，Ilenoosh C，Asheyn O，et al.Kinds of endothelin and its effect on bronchial contraction［J］.Br J Pharmcol，1990，100（5）：168-172.

［6］ 杨敏，陈平.一氧化氮在支气管哮喘中的作用［J］.医学与哲学，2007，28（9）：64-65.

［7］ 刘芳，张新日，张岩.糖皮质激素对机械通气大鼠肺组织iNOS、NO表达的影响［J］.中国比较医学杂志，2011，20（1）：12-15.