重组双基因表达质粒pIRES-NGF-VEGF165转染大鼠BMSCs及表达鉴定

范波胜， 娄季宇， 白宏英

脑梗死缺血坏死区血循环的改善和受损神经组织的修复与功能重建，一直是脑梗死治疗的两个重点，只有这两者的有效解决才有可能提高脑梗死的治疗效果。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是重要的神经营养因子之一，能够促进和维持神经细胞生长、存活，对脑缺血有重要的神经保护作用［1］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是具有高度特异性的促血管内皮生长的细胞因子，能够促进血管新生、改善缺血坏死区的血液循环，是治疗脑梗死极有前途的细胞因子之一［2］。因此，将两者联合应用于脑梗死的治疗有望取得较好的治疗效果。本研究拟采集和培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，并将其作为靶细胞，借助脂质体转染技术将已构建成功的重组pIRES-NGF-VEGF165双基因真核表达质粒导入大鼠BMSCs，以求获得NGF和VEGF的有效表达，为下一步使用NGF和VEGF双基因修饰的BMSCs移植治疗脑梗死大鼠打下重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料 健康1月龄SD大鼠，雌雄不限，体重约120g，用于骨髓搜集，由郑州大学实验动物中心提供;PC12细胞为新乡医学院分子医学实验室王天云博士惠赠;种蛋由新乡市平原鸡场提供。pIRES质粒购自 Clontech公司，重组 pIRES-NGFVEGF165质粒由本研究室构建。Percoll细胞分离液购自Sigma公司，脂质体LipofectamineTM-2000购自Invitrogen公司，总RNA提取试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒购自 QIAGEN公司，兔抗大鼠 NGF、VEGF165多克隆抗体和SP9001试剂盒均购自Santa Cruz公司。

1.2 大鼠 BMSCs的采集与体外培养［3］将SD大鼠断头处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，LDMEM培养液冲洗骨髓腔，收集冲洗液，缓慢加入等体积的Percoll细胞分离液，离心后小心吸取白膜细胞层，PBS洗涤后离心，去上清，加入L-DMEM培养基(含20%FBS，pH7.4)制成细胞悬液，调节细胞密度大于5×106/ml，接种于 50ml培养瓶，置于37℃、5%CO2以及饱和湿度的培养箱内培养。每3d换液一次，待细胞长至80% ～90%时，1∶2消化传代，重复传代，即可得到纯化的BMSCs。

1.3 基因转染 待培养至第3代的大鼠BMSCs细胞长至80% ～90%融合时即可进行转染，分为3组。A组:正常培养的BMSCs;B组:pIRES空质粒转染 BMSCs组;C组:重组 pIRES-NGFVEGF165质粒转染BMSCs组。转染过程按脂质体LipofectamineTM-2000转染试剂操作说明进行。转染后在各组细胞培养液内按400μg/ml加入G418进行筛选，每3d换一次培养液，约1w左右A组细胞全部死亡，其余两组出现抗性细胞克隆，挑选单克隆细胞，将G418浓度降至200μg/ml维持，继续扩增培养后收获细胞和上清液进行下列检测。

1.4 RT-PCR 检测 NGF、VEGFl65 mRNA 的表达 分别根据GENEBANK数据库提供的NGF和VEGF165基因序列，设计NGF的扩增引物为:P1:5’-GCC ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT C3’，P2:5’-GCC TCA GGC TCT TCT CAC AGC CTT C3’;VEGF165的扩增引物为:P3:5’-GGC ATG AAC TTT CTG CTG TCT-3’，P4:5’-GCG TCA CCG CCT CGG CTT GTC-3’。分别提取3组细胞总的RNA，合成cDNA，建立各自的PCR反应体系。NGF的PCR反应条件为:95℃预变性3min，94℃变性40s，60℃退火30s，72℃ 延伸 40s，30个循环后于 72℃ 延伸3min;VEGF的PCR反应条件为:94℃预变性5min，94℃变性 60s，56℃退火 45s，72℃延伸 45s，30 个循环后于72℃延伸3min;反应后取PCR产物进行电泳分析。

1.5 Western blot法检测 NGF、VEGFl65 蛋白的表达 收集各组细胞培养72h的上清液，浓缩后进行SDS-PAGE电泳、转膜和封闭，按1∶200加入一抗(兔抗大鼠 NGF或 VEGF165多克隆抗体)，TBST洗涤后加入1∶1000稀释的HRP标记的二抗，TBST洗涤后在暗室中加ECL检测试剂，X线曝光、显影和定影保存。使用β-actin抗体作为上样对照。

1.6 NGF、VEGFl65 蛋白的活性检测 (1)利用PC12细胞生长试验进行NGF蛋白的活性检测［4］:将PC12细胞用不含小牛血清的DMEM完全培养基接种于24孔板内，收集各组用无血清培养基培养72h的上清液滴加至各孔内，0.5ml/孔。置于37℃、5%CO2以及饱和湿度的培养箱内培养72h，观察PC12细胞生长形态变化。(2)利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生实验进行VEGF的活性检测［5］:将种蛋气室向上放入温箱(37.8℃)，第 8 天时借助照蛋器标记胎位，在绒毛尿囊膜体表投影距胎头1cm处将蛋壳锯开一小三角形孔，虹膜刀切破壳膜，暴露出CAM，将滤纸片贴在CAM上，使用加样器将各组培养72h的上清液100μl加入滤纸上，透明胶带封闭窗口，每日加样一次，第12天时观察CAM新生血管情况。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs的分离、培养及形态特征应用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞，多数悬浮于培养液中，其中以造血细胞占多数，通过数次换液后可清除这些细胞，可见少数细胞贴壁生长，呈圆形，逐渐分裂增殖，形成多个细胞团。第5～10天细胞团迅速生长，向周围不断扩大，相互融合，第10～14天后达到80% ～90%融合;1∶2传代的细胞在1d内即可完全贴壁，不再以细胞团方式生长，呈均匀分布生长的梭形细胞。

2.2 转染大鼠BMSCs及G418筛选 3组细胞加入400μg/ml G418后均出现绝大部分细胞死亡，从瓶底脱落，1w后正常对照组的细胞全部死亡，其它两组细胞仅存留几个细胞贴壁存活，将G418浓度降至200μg/ml维持筛选，约10d后出现抗性细胞克隆，挑取单克隆，置24孔板内继续扩增培养。

2.3 RT-PCR 检测 NGF、VEG165 mRNA 的表达 结果显示:C组能够扩增出726bp和576bp两条目标条带;而A组和B组未能扩出目标条带。表明重组pIRES-NGF-VEGF165质粒转染的BMSCs内有NGF和VEGF165 mRNA的表达。

2.4 Western blot法检测 NGF、VEGF165 蛋白的表达 结果显示:C组在13.2KD和26KD出现两条目标条带，提示有NGF和VEGF165重组蛋白的表达;而A、B组则未见目的蛋白表达。

2.5 转染细胞NGF、VEGFl65蛋白的活性检测

(1)PC12细胞生长试验结果显示:C组细胞培养上清液能够促进PC12细胞发出如神经细胞样突起;而A、B组细胞培养上清液不能促进PC12细胞发出突起，表明转染NGF基因的BMSCs细胞分泌的NGF蛋白具有促进PC12细胞生长的生物学活性。(2)CAM血管新生实验结果显示:C组细胞培养上清液较A、B组细胞培养上清液能够明显促进CAM血管密度增加，血管增粗，分枝增多，表明转染VEGF165基因的BMSCs表达的重组VEGF165蛋白具有促进CAM血管生长的生物学活性。

3 讨论

目前，脑梗死的“三高”(即高发病率、高致残率、高致死率)严重威胁着人类健康，尽管近年来脑梗死的治疗已取得了很大进展，但治疗效果仍不能令人满意，人们一直在探索新的更有效的方法。随着细胞工程和基因工程技术的不断发展，基因治疗已成为脑血管疾病防治的重要研究方向之一，尤其是将多种神经营养因子基因联合应用于脑梗死的基因治疗更是成为最近研究中的热点。

目的基因、基因载体以及靶细胞的选择是进行基因治疗的重要基础，直接关系到基因治疗的成败。本研究选择NGF和VEGF165基因作为目的基因、真核双基因表达质粒pIRES作为基因载体和大鼠BMSCs作为靶细胞来进行脑梗死的基因治疗研究。首先，鉴于脑梗死治疗的原则是既要尽快改善缺血坏死区血液循环又要促进受损神经组织的修复与功能重建，由于NGF对脑缺血有重要的神经保护作用，VEGF则具有促进血管新生、改善缺血坏死区的血液循环的作用，其中VEGF165是VEGF家族中发挥生物学功能的主要成分［2］，因此，我们选择两者作为目的基因。第二，选择真核双基因表达载体pIRES作为基因载体是由于该质粒不但具有一般真核表达载体的特点，更为突出的特点是在两个多克隆插入位点之间设计有微小RNA病毒的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)。IRES可保证插入的两个非相关基因能够同时独立高效地表达，所翻译出的目的蛋白各自具有独立的空间结构和生物活性，这一功能已经有大量实验的证实［6，7］。第三，BMSCs是继胚胎干细胞和神经干细胞之后，又一种在体内外均能向神经细胞分化的干细胞，它具有下列特点［8，9］:(1)易获得性，骨髓穿刺就能得到该细胞，无伦理道德问题;(2)体外培养增殖速度快;(3)可通过血脑屏障到达脑内各部位，并长期存活;(4)免疫耐受;(5)还有可以被冻存和培养等特点，并且相关实验［10］也证实附壁生长的骨髓间充质干细胞易通过基因转染技术导入外源性基因，并可以在体内长期高效表达，因此BMSCs成为对神经系统疾病进行基因治疗的理想靶细胞。

在本研究中，我们借助脂质体转染技术将已构建成功的重组pIRES-NGF-VEGF165双基因真核表达质粒导入BMSCs，经G418筛选，挑选阳性细胞克隆扩增培养。分别从基因和蛋白质水平进行检测，即通过 RT-PCR方法检测到转染细胞中 NGF、VEGF165基因mRNA的表达，使用Western blot方法检测到转染细胞表达NGF、VEGF165蛋白。更进一步进行了两者的活性检测:首先利用PC12细胞进行NGF蛋白的活性检测，PC12细胞来自于肾上腺嗜铬细胞瘤，在有NGF的情况下，PC12细胞可发出突起形成类似神经细胞的表型［4］，我们通过收集转染细胞培养72h的上清液，滴加于PC12细胞培养液中，结果见PC12细胞发出如神经细胞样突起，证实所转染细胞分泌的NGF蛋白具有生物学活性。接着利用CAM血管新生实验进行VEGF165的活性检测:CAM是鸡胚外的一层膜，在鸡胚发育过程中有大量尿囊膜血管的形成，为研究血管发生和形成提供了很好的模型，已经被广泛地应用在促进血管生成和抗血管生成的研究之中［5］。我们通过收集转染细胞培养72h的上清液，滴加于CAM上，可见CAM血管增粗，分枝增多，证实所转染细胞分泌的VEGF165蛋白具有生物学活性。通过上述检测证实，我们成功获得了能够有效表达NGF和VEGF165的大鼠BMSCs，为在下一步研究中将其移植治疗脑梗死大鼠，发挥基因治疗和干细胞治疗-双重治疗效应奠定了实验基础。

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