FTY720通过激活CaMKK/Akt通路减轻全脑缺血再灌注损伤

许 静， 刘志安， 高殿帅

临床及流行病学研究已表明，脑卒中的病因绝大多数是动脉粥样硬化引起，高密度脂蛋白-胆固醇具有抗动脉硬化的作用。临床资料表明高密度脂蛋白在缺血性脑卒中患者明显降低，其保护因素降低可能是卒中发生的原因之一［1，2］。从病因学角度研究高密度脂蛋白受体在治疗脑卒中方面具有重要的临床指导意义。

S1P受体是众多高密度脂蛋白受体的一种，其激活后可以产生广泛的生物学效应，如抑制细胞凋亡、增加细胞内钙离子浓度、调节粘附分子表达等。S1P受体激活的抗凋亡作用在心肌、肾脏等组织缺血中研究较多［3，4］，在脑缺血中的作用则少有报道，其机制更不甚清楚。本研究的目的是探讨S1P受体激动剂FTY720对全脑缺血复灌的神经保护作用，以及其是否通过激活CaMKK/Akt信号通路而发挥保护作用，为脑缺血的临床治疗提供新的策略和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠，250～280g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。实验动物随机分为5组(每组n=8):假手术组(sham组)、缺血/再灌注1d组(I/R组)、I/R+FTY720给药组(F组)、I/R+STO-609给药组(S组)及I/R+溶剂DMSO对照组(D组)。

1.1.2 试剂 p-Akt(S473)及 Akt兔多克隆抗体 (Cell Signal公司);抗CaMKK多克隆抗体、羊抗兔单克隆抗体 (Santa Cruz公司);FTY720(Cayman公司);STO-609(Sigma公司);NBT/BCIP(Promega公司提供);BCA蛋白定量试剂(碧云天生物技术研究所);TUNEL试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，其它常用试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 动物以20% 水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉后制作四动脉结扎全脑缺血模型。全脑缺血15min、再灌注1d后行凋亡和免疫印记检测。缺血前大鼠处于清醒状态，其生命体征完全正常。缺血时保持其直肠温度在36.5℃ ～37.5℃之间。缺血后30～60s内以翻正反射消失、四肢僵直、同时痛觉消失、双侧瞳孔散大等体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。

1.2.2 给药 FTY720以0.5mg/ml的浓度溶于1%DMSO，于缺血前30min以1mg/kg腹腔注射;STO-609以1μg/μl的浓度溶解于1%DMSO，利用微量注射器通过侧脑室于FTY720给药后20min注射(从前囟后开0.8毫米、旁开1.5毫米、深3.5毫米)，每只大鼠给药10μl，10min内注完。注射同体积的DMSO作为阴性对照。

1.2.3 蛋白样品制备 大鼠缺血15min再灌注1d后，快速断头取海马，分区，取CA1区置液氮中冻存备用。使用时从液氮中取出海马加冰冷的匀浆缓冲液匀浆，高速匀浆(10s×6次)，4℃下1000g离心15min去除沉淀物收集上清样品。

1.2.4 蛋白含量测定 采用BCA蛋白定量试剂盒，按说明书操作。

1.2.5 凋亡检测(TUNEL染色) 各组动物以4℃预冷生理盐水、40g/L多聚甲醛行心脏灌注，断头取脑，在视交叉前后1.5mm处冠状切片取材，常规固定、脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，采用Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection试剂盒，按说明书操作行TUNEL染色。

1.2.6 免疫印迹(IB) 等量蛋白样品经10%SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，以湿转或半干转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3%BSA封闭后加入不同的稀释后的一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗，室温反应2h。洗膜后以NBT/BCIP显色，结果以Image图像分析软件处理。

1.2.7 数据处理 数据以均数±标准差表示，统计分析采用方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD)，实验组之间比较采用 q检验(Newman-keuls test)，P ＜0.05为统计学有差异。

2 结果

2.1 各组海马CA1区神经元的凋亡 缺血复灌1d后的凋亡细胞显示不规则形，褐色深染(见图1)。假手术组未见凋亡细胞，缺血复灌1d后引起严重细胞凋亡，TUNEL阳性细胞数为118.8±12.4;给予FTY720后阳性细胞数为55.9±8.1，较I/R组凋亡细胞明显减少(P＜0.05)，保护作用达到50.4%左右;STO-609组凋亡细胞数(90.7±10.5)较FTY720组明显增多(P＜0.05)。

2.2 各组CaMKK表达水平、Akt磷酸化水平给予FTY720后(见表1、图2)，CaMKK免疫印记灰度值为 2.247 ±0.239，p-Akt灰度值为 2.405 ±0.265，较 I/R 组明显升高(P ＜0.05);而 STO-609组 CaMKK 灰度值为1.294 ±0.130，p-Akt灰度值为1.153 ±0.144，较 FTY720 组明显降低(P ＜0.05);各组Akt表达水平无明显变化，溶剂对照组CaMKK表达和Akt磷酸化水平亦无明显变化。

3 讨论

S1P受体有5种类型即S1P1～S1P5，其表达具有一定组织特异性。在哺乳动物的大脑中表达的主要是S1P1～S1P3受体，激动剂为FTY720，其抗凋亡作用在心肌缺血中研究较多，在脑缺血损伤中的作用不甚清楚。有研究发现，局灶缺血再灌注后大鼠梗死灶周围区皮质S1P1的蛋白表达水平明显升高，再灌注后3h、12h 达到高峰，24h 开始下降［5］;在细胞水平上，FTY720可以减少谷氨酸导致的小鼠大脑皮质细胞凋亡［6］;最新研究表明FTY720激活S1P受体显著缩小局灶脑缺血梗死体积，改善神经功能评分，减少了凋亡细胞数量［7］。以上研究结果提示FTY720激活S1P受体后在脑缺血中发挥重要抗凋亡作用。本研究发现给予FTY720可以显著降低I/R导致的凋亡细胞数，进一步证实了FTY720在脑缺血中的神经保护作用，但是具体的信号转导机制国内外少有报道。

S1P受体属于G蛋白偶联受体，S1P受体与Gq偶联［8］引起胞内钙库 Ca2+释放。有研究表明 S1P与其受体结合后，胞内Ca2+释放激活了Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶的激酶 CaMKK从而Akt激活，减轻了内皮细胞的功能障碍［9］，这说明S1P受体介导的内源性Ca2+释放可能起着抗凋亡的作用。长期以来，在Akt信号通路的研究中，一般认为Akt的激活是由PI-3K直接介导的，研究的重点主要集中在PI-3K及其上游激酶上。有研究报道胞内Ca2+浓度下降或是钙调蛋白CaM功能缺失会严重影响一些生长因子介导的Akt活化和神经元的存活［10］;在细胞水平上CaMKK可以直接激活Akt［11，12］，使其T308和S473位磷酸化，促进细胞的存活;另有报道脑源性神经营养因子激活大鼠海马原代神经元上表达的 CaMKK，进而激活 Akt［13］。这些研究表明CaMKK在Akt激活过程中发挥重要的调节作用。Yano等［14］将CaMKK和Akt共转染于COS7细胞中发现Akt被磷酸化而激活，随后在豚鼠预缺血模型中发现Akt磷酸化水平较缺血组升高，CaMKK作为Akt的上游激酶发挥拮抗缺血性损伤的作用。

本研究还发现FTY720显著提高大鼠I/R过程中海马神经元CaMKK的表达和Akt的磷酸化水平，而CaMKK的抑制剂STO-609则逆转了这种作用;TUNEI检测结果也表明给予STO-609后凋亡细胞数较FTY720组明显增多，说明FTY720可能通过激活CaMKK/Akt信号通路发挥其在脑缺血损伤中的抗凋亡作用。

综上所述，S1P受体激动剂FTY720能够提高全脑缺血再灌过程中CaMKK表达水平，进而激活Akt发挥神经保护作用，CaMKK/Akt信号通路可能成为治疗脑缺血的有效靶点，而S1P受体激活后如何启动CaMKK/Akt信号通路，其机制还有待进一步的研究。

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