干细胞用于皮肤组织再生及年轻化的研究进展

常毅 综述 杨松林 审校

干细胞用于皮肤组织再生及年轻化的研究进展

常毅 综述 杨松林 审校

干细胞具有自我更新、自我复制的能力，有望运用于医学发展的各个领域，包括皮肤损伤的再生。年轻化作为皮肤组织再生的另一种形式，干细胞同样有可能在该领域发挥重要的作用。本文就干细胞用于皮肤组织再生及年轻化的研究进展进行综述。

干细胞 年轻化 皮肤 细胞重编程

生物体的组织、器官中存在一定数量的干细胞，以维持其再生或者参与损伤后的组织修复。干细胞是一类具有多向分化潜能和自我更新特点的增殖速度缓慢的原始细胞，可以广泛运用于医学发展的各个领域，皮肤损伤的治疗、组织再生及年轻化就是其中的一个部分。

1 干细胞的定义、分类及研究现状

根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞又可以分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ES细胞）和成体干细胞（Adult stem cell）。胚胎干细胞是从动物早期发育的胚胎内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）或原始生殖细胞（Primordial Germ Cell，PGC）分离得到的一种未分化的永久性细胞系（Embryonic Germ，EG）[1]。

Evans和Kaufman及Martin（1981）分别建立了一种分离多能干细胞的方法，首次获得ES细胞，当时称为EK细胞，之后称为胚胎细胞[1-2]；1983年，Axeirod用微滴法将小鼠晚期囊胚直接培养于STO饲养层（一种成系的小鼠胎儿成纤维细胞培养层）上，获得了 ES细胞系[3]；1984年,Wobus等[4]首次用原代小鼠胎儿成纤维细胞（Primary Mouse Embryonic Fibroblast，PMEF）饲养层培养 ES细胞，并建立了ES细胞系；1987年，Handyside等尝试建立羊的ES细胞系，但未成功[5]。随后，先后在仓鼠、猪、牛、羊、兔、水貂等动物上获得了ES细胞后成功地进行了冷冻和解冻[6]；Shamblott等[7]用5～9周龄胎儿PGC分离克隆出人类ES细胞，经体外分化实验证明，该细胞具有多能性。近年来，对于干细胞的研究有了积极的进步，在医学领域展现了广阔的应用前景，在皮肤再生医学和皮肤年轻化方面同样可得到广泛地应用。

1.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞在含10%FBS和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）的 D-MEM/F12培养基内、不需要饲养细胞就能维持非分化状态，而改用含有胚胎营养因子（Embryotrophic factor，ETFs）培养5 d时，就可以向类白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞分化，该结果提示，ES细胞可用于皮肤再生和创面愈合治疗方面的研究[8]。但是，ES细胞的研究目前存在伦理问题，故对ES细胞的研究和使用均保持着审慎的态度。

1.2 皮肤干细胞

目前尚未清楚干细胞以未分化状态存在的确切机制，但肯定与其周围微环境有关，其中成纤维细胞等间质起源的信号机制可能在其中发挥重要作用。缺乏完全特异的干细胞标记物可能是干细胞的特征之一，是目前难以大量获取干细胞和临床治疗应用的重要原因[9]。利用抗原特异性-流式细胞技术，以及干细胞与基质高黏附、慢生长特性可以进行干细胞分离、培养和纯化。目前公认的表皮干细胞标记物包括细胞角蛋白-15（K15）、K19、β1-整合素和 p53 异构体-p63 蛋白等[10]。有研究显示，使用β1-整合素和α6-整合素抗体进行细胞分离，可获得高纯度的干细胞[11]。然而，属于细胞浆蛋白成分的细胞角蛋白标记物不能用于干细胞的分离和纯化。

1.3 皮肤多能干细胞

Oshima等[12]曾通过LacZ转基因小鼠毛囊的隆突区置换成野生型毛囊，进行嵌合体移植实验和组织学动态研究，结果证实隆突区域的细胞参与毛发、表皮和腺体结构的形成。而且连环蛋白在隆突区域细胞选择性形成表皮细胞或毛发过程中起重要作用[13]。Zuk等[14]研究证实，人体脂肪组织中存在能向软骨细胞、骨细胞和肌细胞分化的干细胞。该细胞具有骨髓间充质干细胞相似的性质，可从脂肪组织中较容易地分离和培养扩增。Okochi等[15]先将小鼠皮肤剪碎，再用胰蛋白酶进行消化分离，悬浮培养1～2周后得到悬浮生长的细胞团。这些细胞在从悬浮培养转为贴壁培养时，会因为分化条件不同而相应地向βⅢ微管蛋白阳性的神经细胞、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的神经胶质细胞分化。同理，也能诱导产生α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的平滑肌细胞和油红（Oil red）阳性的脂肪细胞。由于缺乏可靠的标记物，因此尚未清楚皮肤组织中的这些多能干细胞存在的确切部位。与异体ES细胞和胚胎脑获取的神经细胞相比，自体皮肤诱生的神经细胞不会引发排斥反应，具有更广泛的临床应用价值。此外，来自骨髓的成体干细胞在合适的体内外环境中可分化为表皮细胞、肝细胞、神经细胞和心肌细胞等[16]。

2 干细胞在皮肤再生医学中的应用

严重烧伤患者常应用同种异体皮肤移植，[17]然而，这种移植一般仅能起到暂时覆盖创面的作用。近30年，许多患者得益于通过细胞培养而得到的细胞治疗产品。通过自体表皮角质细胞的培养，大量严重烧伤患者得到了有效治疗[18-19]。

已有的研究证实，多能干细胞可分化为表皮细胞和真皮细胞[21]，多种组织工程皮肤产品已获得美国FDA批准。

Green等[22-23]通过体外培养患者的角质细胞，并将这些细胞产品应用于大面积烧伤患者，可以预防感染和脱水[24]。另外，利用同种异体细胞进行临时表皮细胞替代的治疗方法还可以运用于其他皮肤疾病的治疗，特别是某些皮肤溃疡性疾病和某些遗传性皮肤病[25-27]。

伤口治愈可能并不需要移植组织的永久保存。事实上，无论是生物性的无细胞基层，或者甚至是包含有纤维、胶原蛋白和透明质酸等生物性物质的基层等，在对其进行自体移植的时候，都会和同种异体的角质细胞移植时出现相同的情况，及逐渐排斥。除了对创面的临时覆盖作用，还可以刺激细胞的内生性增殖和创面周围正常组织中的干细胞向创面聚集[28]。

目前，皮肤再生医学方面还包括基因治疗相关内容，如以Ⅶ型胶原基因转染治疗恶性营养障碍性表皮水疱症等[29]。

创伤愈合过程中，生长因子调控着损伤后皮肤再生的全过程，包括细胞趋化、增殖、基质合成与降解、炎症反应等多个方面。因此，在以往的临床实践中，常采用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和角朊细胞生长因子（KGF）等促有丝分裂的生长因子，以加速创面愈合和改善创面修复。然而，上述生长因子的外用效果十分有限，可能与生长因子的半衰期短暂、活性作用和生物利用度较低或需要携带其他（蛋白）分子等因素有关。基因治疗的优点是可以克服生长因子外用的种种不足，能够通过局部活细胞主动和长期的表达来实现。目前，角朊细胞进行基因转染的技术较为成熟，但随着角朊细胞的不断分化，移植物在活体最终以“痂皮”的形式脱落。因此，除干细胞外，将基因导入其他成体细胞，尚无法取得良好的治疗效果。

3 干细胞与人体组织及皮肤衰老的关系

人体组织衰老可以分为病理性及生理性，通过对Hutchinson-Gilford早老综合症（HGPS）的研究，人们试图明白机制的区别；同时，探索对衰老过程的延缓，甚至逆转[30]。

HGPS是人类一种少见并且致命的提前衰老的疾病[31-35]，表现为过早的动脉硬化和血管平滑肌细胞（SMCs）的退行性病变[36-38]。HGPS是由于核纤层蛋白的单个基因位点突变所引起的，而这个核纤层蛋白的基因位点的截短导致了家族中某代出现早老、早熟症状。各器官早老现象的积蓄导致了各种与衰老相关的核功能的障碍，包括核的裂解破碎以及异染色质的缺乏[37-40]。Liu等[30]报道了从HGPS患者体能获得的成纤维细胞所得到的iPSCs。HGPS-iPSCs表现出progerin（导致干细胞激变的某种蛋白）的缺乏，更重要的是，核被膜的缺失是伴随着提早衰老的变化而逐渐形成的。再随着HGPS-iPSCs的分化，progerin和与衰老相关的表型又重新出现。直接由HGPS-iPSCs分化至SMCs，导致早老的各种症状与血管老化密切相关。另外，该研究还鉴别出DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位（DNAPKcs，也被认为是PRKDC）作为progerin的下游目标。细胞核缺少全酶DNAPK与早老及生理性衰老都相关。因为生理性衰老时，progerin也会聚集[36，40-41]。

生理性衰老的过程中或特殊疾病状态下，存在基因改变的蓄积作用，但有望通过细胞重编程加以修复[31，39-40]。最近的研究认为，正常的老化过程和HGPS相关的血管硬化过程，具有相似之处[36，41]。事实上，在生理性衰老的过程中，progerin的水平逐渐增高。在相关报道中可以看出，用progerin依赖的方法，SMCs分化出的HGPS-iPSC比对照组的正常老化过程的表型更早出现[31]。

4 展望

现在的研究认为，皮肤干细胞是皮肤再生的主要资源，皮肤是基因治疗的最适场所，可将皮肤干细胞作为基因治疗的靶细胞。但是，基因治疗还存在安全性和控制表达量等问题[44]。

目前，干细胞的临床应用存在安全隐患。使用动物血清培养干细胞，可能导致动物性病原微生物和病毒感染；异体的干细胞移植可能存在的疾病传染的风险；基因转染的干细胞存在恶性变的可能，尤其是采用病毒载体进行转染时[45]。

因此，在皮肤损伤的修复以及皮肤年轻化中应用细胞治疗，尚属于实验探索阶段，还无法规范化及规模化地应用于临床。但是，现有的研究结果揭示了细胞治疗（尤其是干细胞）在这方面所蕴含的广阔前景，今后必将在皮肤损伤修复和年轻化治疗方面发挥积极的作用，并有可能从根本上改变现有的治疗模式。

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Research Progress of Apply Stem Cell for Skin Tissue Regeneration and Rejuvenation

CHANG Yi,YANG Songlin.Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicina,Shanghai 200233,China.

YANG Songlin(E-mail:alcee@126.com).

Stem cell;Rejuvenation;Skin;Cell Reprogramming

Q813.5

B

1673－0364（2012）05－0298－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.015

200233 上海市 上海交通大学附属第六人民医院整形外科。

杨松林（E-mail：alcee@126.com）。

【Summary】Stem cells have ability of self-renewal and self-replicate.It is widely used in various medical fields,including the regeneration of skin damage.As a special form of tissue regeneration,the rejuvenation is also inseparable from stem cells.In this article,research progress on stem cells for skin tissue regeneration and rejuvenation has been reviewed.

2012年7月14日；

2012年9月25日）