心肌再生的种子细胞的研究进展

陈磊 邓子军 综述 李玉泉 杨向群 审校

心肌再生的种子细胞的研究进展

陈磊 邓子军 综述 李玉泉 杨向群 审校

以往认为心肌再生极为困难，近年来随着种子细胞的研究深入，心肌再生已成为可能，细胞移植已成为心肌病损替代治疗的新兴方向。本文就心肌再生研究领域中用于移植的种子细胞的研究进展进行综述。

心肌 再生医学 种子细胞

急、慢性缺血都可导致心肌细胞坏死、凋亡，并形成瘢痕，最后导致心脏的电生理活动和泵血功能障碍。传统观点认为，心肌是终末细胞，缺乏再生能力，然而心脏干细胞的发现表明心肌是可以再生的。但是，由于心肌再生能力极弱，体内心脏干细胞的数量和再生速度远不能满足缺血后心功能恢复的需求。研究表明，基于细胞移植的再生医学方法可使患者心肌得到再生。本文就心肌再生领域中用于移植的种子细胞的研究进展进行综述。

1 骨骼肌成肌细胞

骨骼肌成肌细胞（Skeletal myoblasts,SM）是最早用于心肌修复的种子细胞[1]，由于来源广泛、体外增殖能力强、在心梗条件下生存能力很强等优势，SM的应用很快进入了临床试验阶段。然而，它在体内并不能转化为心肌细胞，与心肌细胞也不能形成缝隙连接[2]，导致细胞移植后存在同步化障碍和心律失常的隐患。Menasché等[3]报道，移植SM后，患者室性心律失常的发生率明显升高，且未发现心功能改善。美国FDA已禁止将此作为心肌修复的治疗手段。但Roell等[4]发现，通过使SM过表达缝隙连接蛋白43，可增强它与心肌的同步能力，预示着由SM移植造成的心律失常将有望得到预防。目前，SM常用于基因修饰的载体细胞，最近有研究将小鼠SM重编程为iPS，用于修复小鼠心肌梗死获得成功[5]。

2 胚胎干细胞

人胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES）已经成功地被诱导为跳动的心肌细胞，通过使用粒细胞集落刺激因子[6]、维生素C、p38促分裂原活化蛋白激酶抑制剂[7]等，均能显著提高它向心肌细胞的转化率。此外，移植的心肌细胞不但可以长期存活并进一步分化成熟，还能与宿主心肌组织相融合，提高心肌损害动物模型的泵血功能[8]。但ES移植要走向临床，还面临着许多难以克服的缺陷。首先，它的应用存在伦理方面的问题；其次，对诱导后的心肌细胞进行分离纯化和扩增仍然难以完善地解决，尽管已有研究者利用基因抗性、硅石胶态悬浮液梯度离心等方法进行筛选，但还没有发现一种较为成熟和安全的方法适用于临床；再次，分化不成熟或者向其他方向分化的ES在移植后的致瘤性问题目前仍无法解决。最近，用辐射过的ES细胞注入小鼠或恒河猴的心梗部位，使其心功能得到改善，心梗面积也显著减小。该结果表明，ES不需要通过转化为心肌细胞也能修复心肌梗死[9]。

3 诱导性多能干细胞

Takahashi等[10]利用逆转录病毒将4个转录因子c-Myc、Oct3/4、SOX2、Klf4导入人成纤维细胞，获得了诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPS），并成功利用激活素A（Activin A）和骨形成蛋白 4（Bone morphogenetic protein-4，BMP4），在体外将它诱导为跳动的心肌细胞。随后相关研究进一步证实了它向心肌分化的能力。Nelson等[11]报道，将iPS直接移植到心肌内，可以引起心肌细胞的原位再生，并可改善心梗后的心功能。Fujiwara等[12]运用环孢素A提高了iPS向心肌分化的效率。这些研究成果表明，iPS极有可能成为理想的心肌再生种子细胞。但是，由于诱导过程需要转基因，可能存在肿瘤源性基因融合的危险。尽管有报道无需转导c-Myc基因也可以获得iPS，并可以培育出有稳定心肌分化特性的细胞[13]，但其致瘤性仍不能完全克服。因此，在临床应用之前，相关的安全性研究和进一步的动物实验是目前的研究重点。

4 心脏干细胞

1998年，Kajstura等[14]首先在心脏中发现了一类具有自我更新、表达心肌表面标志的细胞，并推断心脏中存在心脏干细胞（Cardiac stem cells，CSC）；后续研究发现，心梗后 CSC可发生归巢、分化[15]。这些结果改变了人们以往对心脏自我稳态维持及损伤修复的认识，同时也为心肌再生的研究提供了一条新的思路。一般认为，CSC主要表达Islet-1、Sca-1、ckit。以干（祖）细胞不同抗原为基础，可将CSC分为c-kit+细胞、侧群 （Side population，SP）细胞和成心肌细胞（Cardioblast）。

研究还证明，除了在体内能够自我更新、横向分化外，CSC在条件培养基中[16]以及和心肌细胞共培养的条件下也能分化为自主搏动的心肌样细胞，造血生长因子和胰岛素样生长因子可以刺激其增殖[17]；其次，是c-kit基因启动了CSC的分化[18]，在心梗发生时，通过激活p38-MAPK途径可使CSC从正常心肌组织向梗死部位迁移[19]；再次，他汀类降脂药能激活心脏原位的CSC增殖、分化[20]，从而能有效地减少心肌死亡。

尽管通过CSC增殖分化可使心肌再生，但在体内并不足以替代病损心肌的功能。因此，Lee等[21]成功地从心肌穿刺标本中分离扩增CSC，通过移植扩增的细胞来改善心功能。由此可见，CSC具有广阔的临床应用前景，目前已进行了Ⅰ期临床试验[22]，相关的基础和临床研究正在进行。随着对CSC认识的深入，以细胞移植为基础，结合心脏辅助技术的治疗策略，有可能成为心肌再生领域中一个革命性的里程碑。

5 骨髓间充质干细胞

Nagaya等[23]将骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSC）移植到大鼠心梗区域后发现，移植的细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并分泌血管源性细胞生长因子，使得梗死面积缩小，心功能显著改善。Gnecchi等[24]发现，在移植72 h内，细胞尚未完全分化为心肌时，即可观察到心功能和移植部位的血供明显改善，因此推测早期的心功能改善不能全部归结于移植细胞的心肌再生作用，而应考虑是细胞移植的其他效应所致；DeSantiago等[25]证实,BMSC通过旁分泌作用抑制心肌细胞死亡，并加强其收缩力；此外，这些信号分子还可增强CSC在缺血缺氧条件下的应激能力，刺激其增殖、分化，并介导其向病损部位迁移[26]。

BMSC不表达MHCⅡ类分子，免疫原性低，可通过与T细胞密切接触而抑制其功能[27]。因此，BMSC的同种异体移植并不需要应用免疫抑制剂。另外，Du等[28]发现，BMSC还具有免疫调节作用，通过抑制NF-kappaB通路，导致TNF-α和IL-6分泌减少、IL-10分泌增多，从而减轻炎症反应对残存心肌的损伤。

尽管上述研究成果说明BMSC适合作为心肌再生的种子细胞，但是临床应用还存在着一些亟待解决的问题。首先，由于缺乏特异性表面标志，BMSC的鉴定将是今后研究的重点之一；其次，细胞诱导和分化机制有待进一步阐明，为临床应用提供可靠的理论基础；另外，细胞诱导及纯化方法需要更深层次的探索，以使其具备临床应用所必须的安全性和可靠性。

6 脂肪组织来源的种子细胞

6.1 脂肪干细胞

2003年，Rangappa等[29]用5-氮杂胞苷成功诱导白色脂肪的脂肪干细胞（Adipose-derived stem cell，ADSC）向心肌分化；次年，Planat-Benard等[30]首次证实了白色脂肪的ADSC可以自发地分化为心肌细胞，Gwak等[31]利用转化生长因子β1也成功地将ADSC诱导为心肌。随后，Choi等[32]构建了一个血管化的、包含hADSC和大鼠心肌细胞的复合物，发现ADSC在体内分化为心肌细胞，并与一同植入的大鼠心肌细胞融合，并参与了新生血管的形成。Metzele等[33]将hADSC与新生鼠的心肌细胞进行共培养，发现在细胞融合后，ADSC不仅能自我更新，还可以和心肌一样呈节律性收缩、产生动作电位，由此推论细胞融合可能是心脏组织中心肌细胞自我更新的机制之一。Bagno等[34]向冠脉结扎的大鼠心室壁注射ADSC，发现心功能较对照组显著提高。Cai等[35]用阿托伐他丁在心梗早期进行预处理后发现，ADSC的移植和分化效率均明显提高。

6.2 去分化脂肪细胞

将成熟脂肪细胞进行“天花板”培养，部分贴壁的细胞吐出脂滴，最终形成成纤维细胞样的去分化脂肪（Dedifferentiated fat，DFAT）细胞[36]，并具备多向分化潜能[37]。 Jumabay 等[38]将DFAT细胞移植到大鼠的心梗区域，8周后在移植的细胞中检测到心肌标志物，梗死区周围毛细血管密度增高。在随后的体外培养中，他们又意外发现小鼠白色脂肪的DFAT细胞能够自发地分化成节律跳动以及静止的心肌细胞，它们表达心肌表面标志，并能稳定增殖，具有4期自动除极化，对心血管活性药物有明显反应[39]。DFAT细胞来源广泛，自体可取，分化增殖能力几乎不受供体年龄影响，与ADSC相比，DFAT细胞来源于纯度达99.9%的成熟脂肪细胞，更加均一，使得DFAT细胞非常适合应用于细胞移植。然而，由DFAT细胞分化而来的心肌细胞仅在表面标志物、电生理特征方面进行了初步研究，其去分化和再分化的机制尚未阐明，对DFAT细胞进行更为深入的研究是十分必要的。

6.3 棕色脂肪来源的心肌前体细胞

Yamada等[40]首次发现在棕色脂肪组织中存在心肌前体细胞（Brown adipose tissue-derived cardiac progenitor cells，BATDCP）。从分离方法上看，BATDCP是对ADSC进一步的筛选、分离后所得到的细胞，但是由于棕色脂肪在成年个体中含量及活性有限，不符合Gimble等[41]提出的适用于再生医学种子细胞的理想标准。Liu等[42]改进了Yamada的分离方法，提高了BATDCP的产率；另外，有研究证明，ADSC和MSC一样具有免疫调节作用[43]，不引起细胞毒性免疫反应，并可抑制炎症，已用于移植物抗宿主病的治疗[44]，使得利用棕色脂肪中的心肌前体细胞进行自体或异体移植成为可能。

7 其他种子细胞

Koyanagi等[45]报道，将从外周血分离出的人内皮祖细胞与大鼠心肌细胞共培养，可使其分化为心肌细胞，用Wnt5a激活PKCδ可以增强其心肌标志的表达[46]。有研究报道，内皮祖细胞移植后，通过新生血管形成和新生心肌形成两种机制，可修复梗死心肌[47]。Lin等[48]认为，从人月经血和子宫内膜中可分离出表达 Oct-4、SSEA-4、Nanog、c-kit的间充质干细胞，它们周期性自我更新、生成血管并分泌多种生长因子，可分化为自主搏动的心肌细胞，移植后未发现肿瘤形成及排斥反应的发生。Ge等[49]利用人羊膜间充质干细胞重编程的iPS成功诱导为心肌细胞。此外，人生精细胞在体外可以转变成ES样、具有三系分化潜能的多能干细胞[50]。因其具有良好的可塑性，无免疫原性，不存在伦理学问题等诸多优点，未来的应用前景十分光明，但致瘤性的相关研究还有待进一步深入和完善。目前，这些研究尚处于探索阶段，尚未用于心脏疾病的治疗，但是为心肌再生提示了一条可能的途径。

随着研究的深入，心肌再生的干细胞治疗在再生医学领域已有长足的发展，它们未来的临床应用也具备无限的可能。但是，对细胞的诱导方法还必须进一步研究和改进，以提高心肌细胞的产率，降低培养成本；对诱导和分化机制必须进行更深层次的研究和探讨，从而保证细胞在临床上应用的安全性和可靠性；对理想的新型种子细胞的探寻仍需继续；制定细胞治疗相关标准、进行规范化的临床前研究以及生物安全性研究，同样是今后的研究重点。尽管面临很多问题和挑战，但心肌再生将成为未来心肌疾病治疗的必然趋势。

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Seed Cells for Cardiomyocyte Regeneration

CHEN Lei,DENG Zijun,LI Yunquan,YANG Xiangqun.Department of Human Anatomy,Institute of Biomedical Engineering;Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

YANG Xiangqun(E-mail:yangxq@smmu.edu.cn).

Myocardium;Regenerative medicine;Seed Cells

Q813.1+1

B

1673－0364（2012）05－0288－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.013

国家自然科学基金（31170934）。

200433 上海市 第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程研究所。

杨向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。

【Summary】Many researches demonstrated that cell transplantation has become an alternative therapy for myocardial diseases in a new direction.Myocardial regeneration was once considered being faced with mountains of difficulties.However,recently,with the advancing study in seed cells,it becomes possible for cardiomyocyte regeneration.The seed cells used in myocardial regeneration was reviewed in this paper.

2012年8月4日；

2012年9月12日）