新致病基因在颅缝早闭Crouzon综合征中的初步机制研究

杨娴娴 Jodie T Hatfield Susan J Hinze 穆雄铮 Peter J Anderson Barry C Powell

新致病基因在颅缝早闭Crouzon综合征中的初步机制研究

杨娴娴 Jodie T Hatfield Susan J Hinze 穆雄铮 Peter J Anderson Barry C Powell

目的 研究 Rbp4（Retinol binding protein 4）、Gpc3（Glypican family of growth factor binding protein 3）、C1qtnf3（Collagenous repeat-containing sequence of 26 KDa protein）等新致病基因在颅缝早闭症中的发病机制，为疾病非手术治疗奠定理论基础。方法 以Crouzon综合征Fgfr2cC342Y/+小鼠为实验模型，应用MicroCT和组织学染色，研究小鼠颅缝闭合模式；以Fgfr2cC342Y/+模型，RT-qPCR研究Rbp4、Gpc3、C1qtnf3等新致病基因的表达差异，初步探讨其在颅缝闭合过程中的调控作用；以体外培养的Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝细胞为模型，研究基因突变动物细胞增殖与代谢改变。结果 获得Fgfr2cC342Y/+小鼠后额缝、冠状缝、人字缝、矢状缝等颅缝闭合模式，随颅骨发育、颅缝闭合，OC（Osteocalcin）、ALP（Alkaline phosphatase）表达增加，目的基因 Rbp4、Gpc3、C1qtnf3 表达下降，Msx2（Muscle segment homeobox gene 2）表达增加，杂合子与野生型小鼠之间均存在显著统计学差异，与前期人颅缝组织Microarray研究结果一致。Gpc1（Glypican family of growth factor binding protein 1）、FliI（Flightless I）在颅缝闭合中的表达较恒定，野生型与杂合子之间未见明显统计学差异。体外培养Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝细胞，CellTiter96 MTS和Quant-iT Picogreen dsDNA细胞增殖与代谢分析结果显示，Fgfr2功能获得性突变可促进冠状缝细胞的增殖，从而导致成骨增加，颅缝早闭。结论 Fgfr2cC342Y/+模型新致病基因表达趋势与前期人颅缝组织Microarray研究结果一致，Rbp4、Gpc3、C1qtnf3可能在颅缝早闭中具重要调控作用。

颅缝早闭症 Fgfr2cC342Y/+小鼠 Crouzon综合征 RT-qPCR 微量CT Rbp4 Gpc3 C1qtnf3

颅缝早闭症是一种常见的先天性颅颌面畸形，新生儿中发病率约为1/2 500，仅次于唇腭裂畸形。由于颅缝提早发生骨性闭合，导致颅腔狭小、颅面骨畸形、颅内压增高等复杂的颅颌面畸形综合征，如Crouzon综合征、Apert综合征等。严重者可引起视力减退甚至失明、脑发育受阻及智力发育障碍，严重影响了患儿的正常发育、生理功能，对患儿的社会生活和心理健康产生了诸多的负面效应，甚至可在发育过程中因危险的并发症而危急生命[1]。目前，对该症唯一的治疗手段为出生后经颅径路畸形矫正、颅腔减压，多需2～3次分期手术，手术风险大，并发症多，费用高，且术后效果不理想。因此，对这类疾病遗传机制的研究与防治具有重要的社会意义。

Coussens等[2]通过5名颅缝早闭症患儿（非综合征性颅缝早闭症4人，Apert综合征1人）取材的16条颅缝组织（含受累及正常颅缝），应用Microarray技术，比较了完全闭合、活跃闭合、未闭合3种颅缝间18 000个基因表达趋势，除 FGFR（Fibroblast growth factor receptor）1～3外，还包括一系列与颅骨发育、颅缝闭合（成骨分化、转录、信号转导、骨塑形、细胞周期和细胞凋亡）相关的新基因。结果显示，受累颅缝与正常颅缝相比，视黄醇结合蛋白-4（Retinol binding protein 4，Rbp4）表达下调 37倍、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican family of growth factor binding protein 3，Gpc3）表达下调 7倍、C1Q 肿瘤坏死因子相关蛋白-3（Collagenous repeat-containing sequence of 26 KDa protein，C1qtnf3） 表达下调 20倍，提示Rbp4、Gpc3、C1qtnf3等新基因在颅骨发育、颅缝闭合中可能存在调控作用。

由于伦理道德问题及复杂实验技术的挑战，从患者或正常人群中获取颅缝组织、细胞用于大规模的实验研究相当困难。因此，制造相关致病基因修饰小鼠模型，进行颅缝早闭症遗传分子机制及基因或细胞治疗的研究是可行的途径。FGFR突变可导致Apert、Pfeiffer和Crouzon等颅缝早闭综合征，现有的基因修饰小鼠模型包括FGFR2+/S252W、FGFR2+/C342Y和 FGFR1+/P250Arg等[3-6]。 Eswarakumar等[5]应用小鼠基因打靶技术，定点突变小鼠胚胎干细胞Fgfr2c基因，以半胱氨酸代替酪氨酸位点（Cys342Tyr），成功制造出FGFR2功能获得性突变 Fgfr2cC342Y/+模型。Fgfr2cC342Y/C342Y纯合子小鼠表现出多关节融合、腭裂和肺气管畸形等，于出生后不久死亡；Fgfr2cC342Y/+杂合子小鼠可存活并繁殖，显示出Crouzon综合征表现型。

本实验将以Fgfr2cC342Y/+小鼠为模型，分析上述新基因在闭合与未闭合颅缝间的表达差异，验证前期的人Microarray研究结果，初步探讨基因在颅缝闭合过程中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验采用Fgfr2cC342Y/+小鼠。Fgfr2cC342Y/+雄性小鼠（美国华盛顿大学Chad Perlyn教授惠赠），与Swiss雌性小鼠（购自阿德莱德妇女儿童医院动物实验中心）配种繁殖。子代中将出现野生型（WT，+/+）或杂合子（Het，+/-）2种基因型。提取鼠尾组织抽提基因组DNA进行基因型鉴定，并进行鼠耳标记。孕鼠经剖宫获取胎鼠，切取实验用颅缝组织后，提取鼠尾组织进行基因型鉴定。按“QIAGEN全血和组织DNA抽提试剂盒”进行操作，PCR扩增突变基因外显子，引物序列为5'-CAAGCAAGCTCAACAG GAGAG-3'（Forward） 和 5'-GCTGTGCTGCTGAGAGTTTTG-3'（Reverse）。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，根据野生型出现224 bp条带，杂合子出现290 bp突变等位基因条带，确定基因型。

1.2 主要试剂

Real-time PCR引物（Geneworks公司，澳大利亚）；TURBO DNA-freeTM试剂盒、BigDye Terminator V3.1测序试剂盒、AmpliTaqGold DNA polymerase（Applied Biosystems公司，美国）；PCR产物纯化试剂盒、Glycogen（Roche 公司，瑞士）；RNase ZAP，DEPC，青链霉素，Alizarin Red S、Tris（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Trizol、SuperScriptTMⅢ逆转录试剂盒、FBS、α-MEM 培养液、10mM dNTPs（Invitrogen 公司，美国）；氯仿、异丙醇、EDTA（APS Ajax Finechem 公司，澳大利亚）；100× SYBR green（Abgene公司，英国）；KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒（Kapa Biosystems公司，美国）；geNormTMHousekeeping Gene Selection试剂盒（Primer Design公司，英国）；Lillie Mayer（Sigma Diagnostics公司，美国）；eosin Y（Surgipath公司，美国）；其余试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备

GeneAmp PCR System 9700基因扩增仪（PE Applied Biosystems公司，美国）；Rotor-Gene 6000 Real-Time PCR 仪（Corbett Reserach，Qiagen公司，德国）；100 孔板（Corbett Research 公司，澳大利亚）；高速台式离心机5415D（Eppendorf公司，德国）；G:BOX凝胶成像分析仪（Syngene公司，英国）；Skyscan 1072/1076 MicroCT扫描仪（Skyscan公司，比利时）；NanoVue超微量分光光度计（GE公司，美国）；倒置相差显微镜（Leica公司，德国）。

1.4 方法

1.4.1 Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝闭合模式研究

1.4.1.1 MicroCT扫描

选择胚胎 16.5 d、18.5 d 及出生 0 d、1 d、5 d、10 d的Fgfr2cC342Y/+小鼠（n=5），解剖获取完整颅盖骨（自鼻根部至颈根部，两侧眼耳平面，包括骨膜、颅骨及其下硬脑膜），分管标记置于10%中性福尔马林瓶中，置于Skyscan MicroCT 1072仪器中扫描，三维图像重建分别由NRecon、CTan v.1.5.0.2和ANT软件完成。

1.4.1.2 HE染色

完成MicroCT扫描后，分别切取冠状缝、后额缝、矢状缝、人字缝复合组织（包括骨膜、颅缝间质、成骨缘及其下硬脑膜），按不同天数及不同颅缝分管标记，5 d以上标本5%EDTA脱钙1～3 d，经组织脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋常规处理，进行HE染色，显微镜下观察不同颅缝不同天数的闭合模式。

1.4.2 Fgfr2cC342Y/+小鼠新致病基因表达研究

1.4.2.1 颅缝标本制备

选择出生后 0 d、1 d、5 d、10 d 的 Fgfr2cC342Y/+小鼠（n=6），分别切取冠状缝、后额缝、矢状缝、人字缝复合组织和颅顶骨（颅缝复合组织包括颅缝间质、成骨缘及其下硬脑膜，切取颅缝时尽可能留小于1 mm成骨缘），分管标记置于5 mL EP管中，-80℃保存。

1.4.2.2 RNA抽提与逆转录

颅缝组织按Trizol法抽提总RNA，加入糖原充分混匀共沉淀，应用20 μL DEPC蒸馏水55℃促溶10 min获得RNA标本。A260/A280、1%琼脂糖凝胶电泳进行RNA纯度及浓度测定。用Ambion公司TURBO DNA-freeTM试剂盒进行DNase处理，去除RNA样品中的DNA污染。

查询NCBI Genbank获取小鼠目的基因编码序列，引物由Primer Premier 5.0软件设计（表1），由澳大利亚Geneworks公司合成，引物干粉按产品使用说明稀释至原液，浓度为100 pmol/μL，工作液再稀释 25 倍为 4 pmol/μL，测序浓度为 3.2 pmol/μL。

将抽提的RNA溶液稀释，取100 ng（至少2 μL），加 DEPC水至 8 μL，采用 SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System试剂盒20 μL体系进行逆转录反应。cDNA经不含RNase/DNase的高压水1∶3比例稀释。所有反应均设定相应No-RT阴性对照（即逆转录反应中，由高压水替代SuperscriptⅢ逆转录酶）。

1.4.2.3 RT-qPCR

验证目的基因与内参基因的扩增效率均为(100±5)%。RT-qPCR 采用 KAPA SYBR FAST qPCR Kit试剂盒10 μL qPCR反应体系，在Rotor-Gene 6000 Real-time PCR仪上进行PCR反应，按①95℃3 min，②95 ℃ 3 sec，③60 ℃ 25 sec，回到步骤②，共40个循环。每一个RNA标本均做2副孔，每一板PCR反应均设定空白对照（NTCs），反应结束后通过熔解曲线分析、凝胶电泳以及测序等鉴定产物的特异性。

针对Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝组织，采用小鼠geNormTMHousekeeping Gene Selection试剂盒（提供候选内参基因PCR扩增引物）进行geNorm分析，显示Cyc1-Gapdh-Canx为最佳组合，选取这3个管家基因Ct值的几何平均值作为内参来对目的基因表达进行校正。

1.4.2.4 目的基因RT-qPCR数据分析

Ct数据分析分别采用传统 2-ΔΔCt法[7]及 qbasePLUS软件法[8－9]，Microsoft Excel、Graphpad Prism 5 软件行Student TTEST检验（双尾、双样本等方差假设）统计，P<0.05则认为两者具显著性差异。

1.4.3 细胞增殖与代谢测定

1.4.3.1 细胞培养

选择出生后3 d的Fgfr2cC342Y/+小鼠6只（野生型、突变型各3只），获取各颅缝及非颅缝区顶骨（剥离硬脑膜和骨膜），分别接种于24孔培养板底部，略微干燥后每孔加入600 mL培养液，37℃和5%CO2的培养箱中培养。第3天换液，观察细胞生长情况，接着每3天换1次液。待细胞长满培养孔，0.25%的胰酶消化传代，转移至12孔板，继续培养，二次传代至6孔板，以获得足够细胞数，三次传代至96孔板以进行MTS和dsDNA实验。

1.4.3.2 CellTiter96 AQueous One Cell Proliferation Assay

将培养在6孔板的冠状缝细胞和顶骨细胞，应用胰酶消化计数，传代至96孔板培养，每孔含8 000细胞数、0.2 mL培养液，每一只动物来源的细胞作6个副孔。传代2板，一板为传代当日4 h后细胞贴壁，一板为培养3 d后，记Plate-1,2，均应用CellTiter96 AQueous One Cell Proliferation Assay Kit来测定细胞增殖代谢的情况。吸除培养基，每孔加入0.1 mL 新鲜培养基，20 μL CellTiter96 MTS solution，37 ℃ 、5%CO2培养4 h，每隔30 min，以ELISA-plate reader测其OD 490 nm吸光值。

1.4.3.3 Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Cell Proliferation Assay

将培养在6孔板的冠状缝细胞和顶骨细胞，应用胰酶消化计数，传代至96孔板培养，每孔含8 000细胞数、0.2 mL培养液，每一只动物来源的细胞作6个副孔。传代2板，一板为传代当日4 h后细胞贴壁，一板为培养3 d后，记Plate-3,4，均应用QuantiTTMPicoGreen dsDNA Reagent and Kits，定量测定dsDNA合成，分析细胞增殖情况，同时观察Plate-1,2 CellTiter96检测后细胞的增殖情况，探讨MTS Kit对细胞的毒性作用。

吸除MTS培养基，PBS洗3次，每孔加入10 μL蛋白酶 K、80 μL PBS、10 μL 甘氨酸（1 M 甘氨酸DEPC、pH=8.0）消化细胞，混匀后孵育 1 h，每孔加入 100 μL PicoGreen Assay work solution，每板按说明构建DNA Standard Curve，所有标本室温避光孵育2～5 min，以FLUOstar OPTIMA微孔板检测仪，荧光激发波长480 nm、发射波长520 nm，测其吸光值。

2 结果

2.1 Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝闭合模式

2.1.1 杂合子小鼠冠状缝

MicroCT及HE染色结果均显示，Fgfr2cC342Y/+小鼠野生型冠状缝在所有取材时间点，直至出生后第10天仍保持开放，而Fgfr2cC342Y/+杂合子冠状缝于胚胎18.5 d开始闭合，第0、1、5天持续闭合，出生后第 10天完全闭合（图1，2）。

2.1.2 野生型及杂合子小鼠后额缝

Fgfr2cC342Y/+野生型及杂合子小鼠出生后第5天，后额缝仍开放，至第10天，少数后额缝出现散在的闭合位点，并非以自前向后的模式闭合，颅缝内层骨面（硬脑膜面）较外层骨面（骨膜面）融合早（图3）。

2.1.3 矢状缝、人字缝

MicroCT及HE染色结果均显示，Fgfr2cC342Y/+小鼠野生型或杂合子，于出生后第10天，矢状缝、人字缝均保持开放。

2.2 Fgfr2cC342Y/+小鼠目的基因表达

随颅骨发育、颅缝闭合，野生型和杂合子小鼠冠状缝OC表达均增加，但两者之间无显著性差异。ALP表达随冠状缝闭合逐渐增加，出生后5 d、10 d，杂合子小鼠ALP表达水平较野生型显著增加（图4）。

目的基因 Rbp4、Gpc3、C1qtnf3 表达下降，Msx2表达增加，杂合子与野生型小鼠之间均存在显著差异，与前期人颅缝组织Microarray研究结果一致。Gpc1、FliI在颅缝闭合中的表达较恒定，野生型与杂合子之间未见明显差异。

2.3 Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝细胞增殖与代谢

MTS和PicoGreen结果ANOVA统计均显示，体外培养的Fgfr2cC342Y/+小鼠非颅缝区顶骨细胞（PB）和冠状缝细胞（Cor）增殖速度存在差异，突变型顶骨细胞较野生型增殖略快，但无明显差异；而突变型冠状缝细胞较野生型增殖显著增加（图5）。

通过PicoGreen测定MTS分析后细胞（Plate-1,2）与新鲜细胞（Plate-3,4）间的增殖差异，结果表明，经MTS分析后，培养板中的细胞数较新鲜细胞减少约1/3～1/2。尽管如此，应用MTS分析后细胞进行PicoGreen分析，仍可出现冠状缝突变型较野生型增殖增加，并具统计学差异。

表1 定量PCR检测基因及引物序列Table 1 RT-qPCR target gene and primer list

图1 Fgfr2cC342Y/+小鼠冠状缝闭合MicroCT检测Fig.1 Representative MicroCT images comparing wildtype and Fgfr2cC342Y/+mice sutures

图2 Fgfr2cC342Y/+小鼠冠状缝闭合HE染色Fig.2 HE staining of wildtype and Fgfr2cC342Y/+mice coronal sutures

图3 Fgfr2cC342Y/+小鼠后额缝闭合MicroCT和HE染色Fig 3 Representative images displaying posterior frontal suture fusion in Fgfr2cC342Y/+mice

图4 Fgfr2cC342Y/+小鼠冠状缝目的基因表达相对定量图Fig.4 Relative target gene expression from wildtype and Fgfr2cC342Y/+coronal sutures

图5 Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝细胞Picogreen增殖定量分析Fig.5 Picogreen quantification of cell proliferation in Fgfr2cC342Y/+mice

3 讨论

FGFR2突变是颅缝早闭症最常见的基因突变类型（已明确突变类型超过40种），主要见于Crouzon和 Pfeiffer综合征 Cys342Tyr(C342Y)突变[10]。此外，还见于Pfeiffer综合征Trp290Cys突变[11]、Beare-Stevenson 综合征 Tyr375Cys突变[12]、Apert综合征 S252W[13]、Q289P[14]突变以及 Jackson-Weiss综合征[15]等。

小鼠模型常用于人颅缝闭合模式研究。本实验采用Fgfr2cC342Y/+小鼠，结合MicroCT与组织学，作为颅缝闭合模式的常规实验方法。颅缝闭合分3种模式①开始闭合：MicroCT示颅缝少数位点出现闭合，组织学在不同层面可分别获取闭合与开放两种切片；②活跃闭合：MicroCT示颅缝多数位点已经闭合，组织学可获得闭合与开放两种切片，以闭合为主；③完全闭合：MicroCT示颅缝纵轴方向及横断面（颅骨内层、颅骨外层骨面）均已闭合，组织学结果相同。

本实验中Fgfr2cC342Y/+小鼠MicroCT与组织学染色结果相符，Fgfr2cC342Y/+杂合子小鼠冠状缝E18.5开始出现闭合，P0、P1、P5属于活跃闭合期，P10颅缝完全闭合，而野生型小鼠冠状缝所有时间点均保持开放，故选择上述时间点进一步比较闭合与未闭合颅缝间致病基因的表达差异和颅缝细胞增殖矿化情况。

本实验中，常规选择 OC（Osteocalcin）、ALP（Alkaline phosphatase）作为标志物。OC由分化晚期的成骨细胞分泌，表达水平逐渐增加，因此可作为成熟成骨细胞的功能标志物[16]。ALP被视为成骨细胞分化的早期标志，随颅缝闭合逐渐增加[17]。

Rbp4，视黄醇结合蛋白-4，为分泌性血浆蛋白，负责运载肝脏视黄醇向血液、组织传输，在组织中催化转变成视黄酸（RA）[18]。Rbp4在肝外组织中的表达包括脂肪、肾、软骨、脑组织以及胚胎发育的口腔颌面区域。Rbp4基因敲除小鼠表现出颅骨畸形[19]。Coussens等[16]的前期研究发现，Rbp4定位于人颅缝成骨前缘的颅骨外层骨面骨细胞以及类骨质中，闭合颅缝较未闭合颅缝RBP4表达下调37倍。我们推断，Rbp4-视黄醇-RA代谢系统的紊乱可引起颅缝早闭症，可能与FGF/FGFR信号通路相关。

Gpc3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖（Gpc）家族成员之一，为膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链（HS）和糖基化磷脂酰肌醇（GPI），Gpc蛋白通过GPI锚定于细胞外膜上[19]。Gpc3在哺乳动物的胚胎期可通过影响多个信号通路而对组织器官的发生和生长发挥重要调控作用，目前主要集中在基因与肝细胞癌相关性的研究[20-21]。前期研究发现，人闭合颅缝Gpc3表达较未闭合颅缝下调7倍。GPC3低表达可能促进颅缝区间充质细胞分化、成骨细胞增殖或抑制细胞凋亡，从而导致颅缝过早闭合。

C1qtnf3，C1Q肿瘤坏死因子相关蛋白-3（又名CTRP3/cartducin，Cors26），在胚胎发育及出生后均可调节软骨细胞及其前体细胞的增殖[22]。前期研究显示，C1qtnf3在人颅缝组织中表达，闭合颅缝较未闭合颅缝C1qtnf3表达下调达20倍，通过与软骨特异性标记物共表达。我们推断，C1qtnf3除调节颅缝成骨前体细胞的增殖与分化外，尚可能调节软骨的生成而引起颅缝的闭合。

Fgfr2cC342Y/+小鼠颅缝新致病基因表达分析结果证实，Rbp4、Gpc3、C1qtnf3基因表达模式与小鼠模型与颅缝早闭症患者Microarray结果相一致，可进一步运用于发病机制的研究。Gpc1、FliI在颅缝闭合中的表达较恒定，野生型与杂合子之间未见明显统计学差异，提示两基因可能与颅缝早闭症无相关性。

本组实验中MTS和PicoGreen的结果均显示，Fgfr2cC342Y/+小鼠，Fgfr2功能获得性突变致使突变型冠状缝细胞较野生型细胞的增殖量显著增加，颅缝成骨增强而发生颅缝早闭。此外，本实验提示MTS试剂对培养细胞具有明显的毒性。

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Fgfr2cC342Y/+Mouse Model of Crouzon Syndrome in Craniosynostosis

YANG Xianxian1,Jodie T Hatfield2,Susan J Hinze2,MU Xiongzheng3,Peter J Anderson2,Barry C Powell2.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Australian Craniofacial Unit,Women's and Children's Hospital,Women's and Children's Health Research Institute,Adelaide,Australia;3 Department of Plastic Surgery,Huashan Hospital,Fudan University School of Medicine,Shanghai 200040,China.

MU Xiongzheng(E-mail:craniomu@gmail.com).

ObjectiveTo investigate a number of novel genes and their molecular mechanisms at play during the premature suture fusion using Fgfr2cC342Y/+mouse model.MethodsThe pattern of cranial suture fusion in Fgfr2cC342Y/+mice(a Cys342Tyr replacement into Fgfr2c to create a gain-of-function mutation equivalent to a mutation in human Crouzon syndromes)were analyzed using microCT and histology.geNorm assay was used to indentify the most stably expressed reference genes in mouse suture tissues and to determine the minimum number of genes required to calculate a reliable normalization factor.Expression of target genes Rbp4,Gpc3,C1qtnf3 etc and markers of osteogenesis were assessed using RT-qPCR during suture fusion and osteogenesis.Comparision of suture cell proliferation in both wildtype and Fgfr2cC342Y/+mice was conducted to analyze the functional basis for the skeletal phenotype of this mutation.ResultsPosterior frontal suture fusion began to occur as early as 10 days in both wildtype and Fgfr2cC342Y/+mice.Fgfr2cC342Y/+mice experienced coronal fusion as early as embryonic 18.5 days and obliterated at 10 days,while wildtype remained patent at all time points.Cyc1,Gapdh and Canx were the most stably expressed housekeeping genes for accurate realtime PCR analysis.A correlation between suture fusion and Rbp4,Gpc3,C1qtnf3 down regulation were demonstrated in Fgfr2cC342Y/+mice.MTS metabolic assay and Picogreen dsDNA quantification analysis showed a significant increase of coronal suture cell proliferation with no change in parietal bone osteoblasts in heterozygote mice.ConclusionSuture fusion in Fgfr2cC342Y/+mice were assessed as a pilot experiment.Fgfr2cC342Y/+mouse model of craniosynostosis syndrome was suitable for molecular mechanism study on suture fusion,particularly for novel gene analysis with FGF signal pathway.Rbp4,Gpc3,C1qtnf3 down regulation during suture fusion was consistent with the human study which suggested may play an important role in bone growth and suture maturation.Fgfr2 gain of function mutation resulted in increased coronal cell proliferation which may lead to increased osteogenesis and premature suture fusion.

Craniosynostosis;Crouzon syndrome;Fgfr2cC342Y/+;RT-qPCR;MicroCT;Rbp4;Gpc3;C1qtnf3

R726.2

A

1673－0364（2012）05－0256－08

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.004

国家自然科学基金（81171835，81201483）；上海市科委非政府间国际合作项目（10410701300）。

200011上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（杨娴娴）；澳大利亚颅颌面外科中心，阿德莱德妇女儿童健康研究中心（Jodie T Hatfield，Susan J Hinze，Peter J Anderson，Barry C Powell）；200040 上海市 复旦大学医学院附属华山医院整形外科（穆雄铮）。

穆雄铮（E-mail：craniomu@gmail.com）。

2012年5月14日；

2012年7月30日）