溶藻弧菌对水产动物致病性及其防治的研究进展

苑淑宾，朱爱意

(浙江海洋学院海洋科学学院，浙江舟山 316004)

溶藻弧菌Vibrioalginolyticus是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜[1]，隶属于弧菌科Vibrionaceae、弧菌属Vibrio，是一种常见的海洋致病菌，在世界各地海水及河口处广泛分布[2]，并且其数量居海水类弧菌之首[3]。因其生物学性状有许多与副溶血性弧菌相似，在《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版(1974)中将其列为副溶血性弧菌生物I型菌(副溶血弧菌为生物l型)。可对人引起伤口感染、食物中毒[4]、中耳炎[5]等疾病。同时，它也是鱼、虾、贝等海水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化时机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发[6]，特别当水温在25～32℃下容易流行[7]，因此养殖动物的溶藻弧菌病多发生在夏季，爆发时往往会造成水产养殖业巨大经济损失[8]。

随着科学技术的进步，有关溶藻弧菌致病性的研究越来越多，人们对其致病机理的认识也越来越详细。本文主要针对溶藻弧菌的病原性、致病性及其防治的研究进展作了概述。

1 病原学特征

目前为止，溶藻弧菌能够使其致病的已见报道的鱼类有很多，黑鲷Sparus macrocephlus、大黄鱼Pseudosciaena crocea等[9～20]感染溶藻弧菌病的主要症状表现为：表皮发生溃疡、出血、常有黑斑，眼球凸起、充血，腹部充水肿胀，肾脏发白，脾脏肿大、常有小瘤伴生，肝脏充血、损伤；平鲷Rhabdosargus sarba、鮸状黄姑鱼Nibea miichthioides[21～23]等感染溶藻弧菌后导致溃疡病，感染初期病鱼体色变深，感染组织常发生充血、发炎等症状，严重时病鱼鳍间组织逐渐散开、溃烂，鳍条溃烂，体表其他感染部位可能会发生损伤、溃烂，再严重可能最终导致死亡；溶藻弧菌还能引起日本对虾Penaeus japonicus[24]、斑节对虾Penaeus monodon等[25]的白斑病，主要症状表现为：甲壳有白斑；还会导致中国明对虾Fenneropenaeus chinensis[26-27]黑鳃、褐斑综合症，也有人称之为红腿病，主要症状表现为：部分鳃丝呈深黑色，从甲壳外侧可见头胸甲壳内部有黑色物质附着，体表甲壳有黑斑。还可导致凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei[28]会染上红体病，整个虾体变成红色，肝胰脏有些肿胀，头胸甲容易剥离。溶藻弧菌感染不同鱼、虾、贝类，导致的病症略有不同。

2 致病机理

细菌生物膜(Biofilm，BF)，也可称为生物被膜，主要是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体[29～32]。BF中存在各种主要的生物大分子，比如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。BF的多细胞结构的形成包括细菌起始粘附、BF发展和成熟等阶段，是一个动态过程。在不同阶段，细菌的BF生理生化特性也不同。弧菌属的细菌几乎都能形成具自我保护功能的生物膜，使其更易入侵和感染生物体，而BF的存在可能与慢性疾病的产生和疾病的大流行有关[31]。

总体而言，BF细菌主要有两种致病机制：

(1)抗免疫机制：对抗宿主机体免疫防御机制，BF细菌可利用多种方式，比如抑制中性粒细胞的趋化作用、减少宿主机体细胞因子(cytokine)的产生、酶解宿主细胞因子等。

(2)抗药机制：BF的多细胞结构决定了它的抗药性。BF细菌对抗生素的抗性要超过浮游细菌10～1 000倍。BF抗宿主机体免疫防御的机制或抗药往往是多个机制协同起作用。

溶藻弧菌是一种重要的伺机性病原体，在人体和养殖水产动物上能够引起各种不同症状的弧菌病。同其他具生物膜的细菌一样，溶藻弧菌的致病性由它与宿主细胞间的相互作用决定的，致病过程大致包括粘附、侵袭、体内增殖及产生毒素等过程[29]。生物膜细菌主要是在侵袭宿主机体的和增殖的过程中损伤组织细胞，同时在宿主体内产生毒素等一些代谢产物，这些代谢产物能够通过破坏或者是干扰宿主的全身或局部的正常新陈代谢或机能，而并且最终引起宿主发生病变[30]。而致病菌引发宿主发生病变过程与其产生的各种代谢产物有关。

2.1 致病因子

溶藻弧菌的致病因子有很多种，主要包括四个大部分，分别是粘附素、胞外产物(如碱性丝氨酸蛋白酶和胶原蛋白酶等)、外膜蛋白及摄铁系统等。不同的致病因子在其感染宿主的不同时期起着不同的作用。

2.1.1 粘附素(Adhesin)

细菌感染的第一步是粘附，通过粘附，致病菌才有可能侵入宿主体内，进而产生并毒素，并最终使宿主致病[31]。通过粘附病原菌在宿主易感细胞上获得立足点，繁殖，然后通过释放毒素和酶类损坏宿主组织或细胞，进而导致感染。而细菌的粘附作用主要依靠粘附素来完成，粘附素能够特异性识别并结合到宿主细胞。宿主感染致病的一个必要条件就是细菌的粘附，粘附对于细菌侵入宿主并进一步有效发挥毒素等的作用具有重要意义[32]。

溶藻弧菌粘附素方面的研究不多国外的学者对溶藻弧菌粘附素作了一定的研究。BAFFONE等[33]研究了20株溶藻弧菌对Hep-2细胞的粘附情况，结果发现有11株菌对Hep-2细胞有比较强的粘附作用。ZANETTI等[34]的研究发现溶藻弧菌可粘附在上皮细胞上。BALEBONA等[35-36]研究表明，溶藻弧菌对鲤鱼Cyprinus carpio上皮细胞、黑鲷红细胞无粘附作用；但是对黑鲷的肠粘膜、鳃、表皮都有较强的粘附作用；但可粘附在大鳞大麻哈鱼(King salmon)胚胎细胞上。

粘附一般需要具备两个基本条件：粘附结构和宿主细胞表面有特异性受体。除了这两个基本条件之外，粘附还与细菌本身的一些生物学特性及环境因子有关系[28,37]。致病菌对真核细胞表面的粘附一般需要粘附素来介导，粘附素在真核细菌的感染过程中起着重要作用。弧菌的粘附素可以分为很多种，总体上可分为菌毛粘附素和非菌毛粘附素两大类，菌毛粘附素包括菌毛、纤毛等；外膜蛋白、脂多糖、胞外多糖等则属于非菌毛粘附素[38]。

鞭毛在溶藻弧菌粘附宿主过程中起重要作用。MEADOWS[39]提出假设：细菌的鞭毛在细菌感染的粘附过程中有着无可替代的重要作用。DeBOER等[40]在MEADOWS研究的基础上作出假设：周生鞭毛是使溶藻弧菌能够粘附在宿主或环境中物体表面的一个重要因素。根据鞭毛的位置，可以分为两种鞭毛类型：端鞭毛和周生鞭毛。但是条件不同时，两种鞭毛的地位和作用也不同。在液态环境下以端鞭毛为主，而在固态环境下则以后者为主。BELAS等[41]对不同类型鞭毛的弧菌在甲壳质上的吸附特性进行了研究，研究结果表明：当在适应表达周生鞭毛的条件下，像溶藻弧菌这样具有混合类型鞭毛的弧菌，它们在甲壳上的吸附情况符合“朗缪尔吸附等温式”，但是当菌浓度达到一定程度时会出现吸附饱和的现象；而在适应表达端鞭毛的条件下则不符合朗缪尔吸附等温式”，也无饱和现象。研究结果也表明了：周生鞭毛菌相对端鞭毛菌对甲壳质的亲和力要强，而且周生鞭毛菌可以抑制端鞭毛菌的吸附。这些结果说明周生鞭毛有利于溶藻弧菌的吸附。BORDAS等[42]在BELAS等的基础上展开了溶藻弧菌对黑鲷表皮粘液的粘附动力学研究，其研究结果与BELAS等的结果一致。SAKAMOTO等[43]对具有不同形态的2株突变体的运动能力进行比较分析，发现具有端鞭毛的YM4可以借助其端鞭毛进行运动，而无端鞭毛的NMB198菌株的溶藻弧菌不能运动。

2.1.2 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)

组成细菌内毒素的主要部分是脂多糖(LPS)，它由一条特异链、核心多糖和类脂A三部分组成，是革兰氏阴性菌细胞壁中的主要成分之一。陈昌福等[44]对柱状嗜纤维菌的研究结果表明脂多糖是柱状嗜纤维菌重要的一种共同保护性抗原，如果以脂多糖作免疫抗原，可以显著增强动物的免疫保护力。在病原弧菌中，鳗弧菌Vibrioanguillarum、创伤弧菌V.vulnificus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、海鱼弧菌V.damsela、霍乱弧菌V.cholera、拟态弧菌V.mimicus等的脂多糖都已经被证明与弧菌的致病过程有关，脂多糖是这些病原弧菌共有的一种重要致病因子[45]。1981年，HISATSUNE等[46]研究了溶藻弧菌的糖组分，发现溶藻弧菌的脂多糖与一般的细菌不同，它的内核骨架成分不是2-酮-3-脱氧-D-甘露糖型-辛酮糖酸(KDAO)，而是KDAO类似物。陈晓燕等[45,47]研究了点带石斑鱼Epinephelus coioides野生五带豆娘鱼Abudefduf vaigiensis人工感染溶藻弧菌后LPS在鱼体组织内的分布情况，结果发现：溶藻弧菌的脂多糖可以被肾脏、脾脏、肝脏、小肠等内脏组织吸附。鄢庆枇等[48]对溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性情况进行了研究，在对大黄鱼肌肉注射剂量为0.2 cm3不同浓度脂多糖溶液的毒性试验中，脂多糖注射浓度为0.5 mg/cm3时，5 d内能引起大黄鱼死亡；当脂多糖质量浓度达到2.0 mg/cm3时，大黄鱼的死亡率达到100%。以剂量为0.2 cm3浓度为9×108个/cm3的溶藻弧菌进行攻毒试验，40%的大黄鱼获得免疫保护。

2.1.3 摄铁系统(Ferric uptake system)

铁摄取系统在溶藻弧菌的生存和致病性方面，都有重要的作用[49]。众所周知，铁是血红蛋白结合氧原子的一个要素，机体感染溶藻弧菌后，弧菌的摄铁系统从宿主血红蛋白中夺取铁，从而导致宿主机体供氧不足，贫血，甚至死亡。到现在为止，有关溶藻弧菌摄铁系统方面的研究还比较少。BALEBONA等[50]研究发现溶藻弧菌有能从宿主铁螯合蛋白中获得铁离子的载铁体。钱荣华等[37]通过对溶藻弧菌铁调蛋白基因的克隆、表达及其特征分析研究，结果显示：该基因序列全长为994 bp，当中包含开放读码框450 bp，编码150个氨基酸残基的蛋白，推导的相对分子量为16.78 kDa。确定了在编码序列的上下游的RBS序列、-10序列、-35序列和2个潜在的转录终止子，但没有发现存在于大肠杆菌fur基因中的“铁盒子”。氨基酸序列中的高度保守区域为G46位至D104的位段，在这一位段中包括含组氨酸丰富铁结合模型(H3-D-H-LV-C-L-D-C-G)。SDS-PAGE分析表明，fur基因可在大肠杆菌中大量表达，Western-blot分析结果显示，fur蛋白具有免疫反应性。王蓬勃等[49]研究了海洋动物病原菌溶藻弧菌的铁摄取机制，溶藻弧菌能够在高浓度铁螯合剂2′-2′二联吡啶的培养基中存活，在限铁环境中，溶藻弧菌生长受到抑制，补加铁可以消除这种抑制作用。通过铁载体定量检测，发现分离于发病鱼体的溶藻弧菌MVP01产铁载体量大于分离于海水的菌株NO1111587。互补实验证明溶藻弧菌的铁载体粗提物能够被铁载体合成缺陷的大肠杆菌突变株AN93利用，在铁限制培养环境中，溶藻弧菌合成了约80 kD铁调控外膜蛋白。

2.1.4 外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)

近几年来，专家学者们较深入地研究了弧菌的OMP，研究发现OMP和细菌的粘附及摄铁过程密切相关，它们相互起作用，OMP也是一种非常重要的致病因子[52]。一般弧菌具有多种OMP，目前已知弧菌最小分子量为39 kDa的OMP实际上是最小弧菌的血凝素，粘蛋白、胎球蛋白等糖蛋白能够抑制它的血凝作用，而单糖类、二糖类以及N-乙酞糖类则不会抑制血凝作用，能介导最小弧菌近距离粘附在红细胞上。研究发现，创伤弧菌具有两种分子量分别为72 kDa和77 kDa的OMP，它们受铁离子调节，主要参与铁的吸收过程[53]。在鳗弧菌775的摄铁系统中有一个重要组成部分就是鳗弧菌775的外膜蛋白OM2，它的分子量大小为86 kDa。OMP作为鳗弧菌素与铁离子复合物的受体而发挥作用，而最终使宿主致病。除了OM2之外，在鳗弧菌摄铁的过程中还有另外一种外膜蛋白OM3也有参与，它的分子量大小为79 kDa。SIMON等[54]的研究认为鳗弧菌的主要外膜蛋白可能是鳗弧菌各个不同血清型的共同抗原。

2.1.5 胞外产物(Extracellular Products，ECP)

胞外产物也是一种重要的致病因子溶藻弧菌可以产生多种胞外产物，这些胞外产物大都与其致病性有关，比如蛋白酶类及外毒素，它们是导致宿主致病的主要毒力因子[37]。

a.ECPase

ECPase具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等4种酶活性，其中淀粉酶的活性最高，酪蛋白酶、脂肪酶活性次之，卵磷脂酶活性较低[56,58]。林业杰等[55]对溶藻弧菌致病性的研究结果表明：发现小鼠感染此菌后3 h即开始发病，至48 h全部死亡；有5.5%和22.5%的菌株分别产生ST和LT肠毒素。BALEBONA等[56]经肌肉将ECPase注射鱼体，6 h后观察到注射部位有细胞溶解的现象，24～72 h就可引起死亡，由此推断ECPase对鱼类细胞有较强的毒性。LEE等[57]研究发现，溶藻弧菌ECP在对虾的溶藻弧菌病中起着重要作用，能够引起日本对虾血浆中抗脂多糖因子消失、血蓝蛋白减少。ECPase能溶解断斑石鲈Pomadasys hasta、眼斑拟石首鱼Sciaenops ocellatus和赤点石斑鱼Epinephelus akaara的红细胞，而不能溶解鸡、羊和O型人的红细胞；对小白鼠和石斑鱼的LD50分别为0.08 mg/g和0.17 mg/g，95%可信限分别为0.06～0.12 mg/g和0.07～0.28 mg/g；50 mmol/L EDTA和 100 mmol/L苯甲基磺酰氟能使溶藻弧菌胞外蛋白酶(Extracellular proteinase，ECPase)的活性分别下降83.40%和51.32%；ECPase对热稳定性较差，碱性条件下活性较高，其最适温度为50℃，最适pH为8.0。

b.溶血素(Helmolysin)

溶血素是一种能特异性地结合于红细胞的抗原型的灵敏的、互补固定抗体，这种抗体可由该表面抗原刺激而产生，可导致红细胞溶解释放出血红蛋白。现已证明溶血素是鳗弧菌和副溶血弧菌重要的毒力因子[59]。BAFFONE等[60]研究了20株海域分离出的溶藻弧菌，其中有1株菌能够产生肠毒素，并且进而导致小白鼠致病，但这20株溶藻弧菌都没有溶血活性。权太淑等[61]从溶藻弧菌中检出耐热溶血素，神奈川实验有86%的菌株呈现阳性。

c.碱性丝氨酸蛋白酶(Alkaline serine exoprotease，AspA)

碱性丝氨酸蛋白酶是一种蛋白酶，在动植物、真菌、病毒以及细菌中广泛存在。AspA主要参与蛋白质的翻译后加工、组织降解、细胞分裂、病原体感染和细胞凋亡等多个过程。1981年，LONG等[62]首次报道了溶藻弧菌可以产生碱性丝氨酸蛋白酶。CHEN等[63-64]研究认为碱性丝氨酸蛋白酶是溶藻弧菌分泌的主要蛋白酶，能使对虾致死，可被酶抑制剂苯甲基磺酸氟(PMSF)所抑制。HARE[65-66]和DEANE等[67]对溶藻弧菌能产生碱性丝氨酸蛋白酶的种类以及组氨酸调节碱性丝氨酸蛋白酶的产生机制作了研究，发现溶藻弧菌能产生6种分子量不同的SDS抗性的碱性丝氨酸蛋白酶，碱性丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制这些蛋白酶的活性，组氨酸(His)对这6种酶的活性没有抑制作用，这6种蛋白酶的分子量都小于30 kDa。DEANE[68]用极限培养基或琥珀酸极限培养基得到了3种SDS抗性的碱性丝氨酸蛋白酶的ProA、B、C分子量。1989年，DEANE等[69]已经测出了ProA的核苷酸序列。LEE等[70-71]有报道称溶藻弧菌能产生一种碱性丝氨酸蛋白酶，这种酶的分子量大小为33 kDa。

d.其他胞外产物的研究

除以上介绍的几种常见的毒素因子外，胶原酶也是研究较多的一种胞外产物。它是一种含锌的金属蛋白酶，但是这种酶只作用于胶原或其变性明胶[73-75]。胶原酶的三螺旋结构完好时，不容易降解，必须在受到破坏在后才能降解。内源性组织胶原酶虽然在增生性瘢痕中的含量比较高，但是它的活性作用受到TIMP的抑制，因此不能有效地发挥[76]。

总之，细菌体内导致有机体致病的毒力因子可能有很多，一般情况下是多种毒力因子相互作用的结果。LEE等[51]报道，从死亡及濒死的龙虾的肝脏、胰腺和血淋巴中分离出一种弧菌，经鉴定为溶藻弧菌，该菌的毒力因子主要为铁转运系统、细胞外溶血素及ECPase，尤其是细胞外产物起着主要作用。

3 溶藻弧菌病的防治

目前，国内有关溶藻弧菌疫苗的研究相对国外较多，特别是灭活疫苗和亚单位疫苗，国内现已有了较为详细的研究。

免疫刺激是能够增强鱼体免疫力和疾病抵抗力的一种有效方式，因此溶藻弧菌的灭活疫苗能够在一定程度上提高机体免疫能力。曹剑香等[78]用甲醛灭活溶藻弧菌，将灭活疫苗通过口服免疫凡纳滨对虾，从而获得了较高的免疫保护率。王海芳等[77]用溶藻弧菌制备全细胞、全细胞-FCA、LPS 3种疫苗，经免疫接种后，结果表明：免疫组的抗体效价及其他各免疫指标较对照组显著要高，在攻毒之后，都表现出很好的免疫保护力，其中最高的属全细胞-FCA组，免疫保护力高达85.7%。丁燏等[13]用福尔马林灭活法溶藻弧菌，制备了溶藻弧菌的全菌疫苗，免疫接种后发现：灭活疫苗提高了黄鳍鲷Sparus latus的免疫功能，使得在攻毒时黄鳍鲷的死亡率大为减少。

KRUPESHA SHARMA等[31]研究了各种营养浓度和孵化时间条件下的溶藻弧菌生物膜的形成。结果表明：溶藻弧菌生物膜形成的最佳条件是在0.15%的胰酶解大豆酪蛋白肉汤中培育3 d，生物膜细胞在80℃条件下10 min或者浸在10%的福尔马林中24 h完全灭活。与游离细胞相比，SDS-PAGE形成的生物膜细胞可以抑制4种蛋白质、表达3种蛋白质。初步的研究表明溶藻弧菌在刺激斑节对虾的非特异性免疫在对热和对化学物质的抗性等方面生物膜细胞要优于游离细胞。因此，只要控制环境也可以有效地避免溶藻弧菌的感染。

脂多糖作为革兰氏阴性菌的一种致病因子，在病原菌的感染机制中起着不可替代的作用，但与此同时，脂多糖也可表现出显著的有益作用，如在轻微的感染条件下，它不仅可以增强机体的非特异性抵抗力，还能够抗肿瘤以及诱发机体产生特异性抗体[79]。虽然脂多糖是一种重要的疫苗材料，但是要想将LPS制成疫苗用于水产养殖动物的病害预防，首先必需要解决两个方面的问题：安全性和保护率。由于脂多糖对养殖鱼类具有一定的毒性，高剂量时可能会引起养殖动物的死亡，即使在低剂量时，也可能会引起鱼体器官的损伤，因此，需要对LPS进行一定的处理，尽可能地降低它的毒性，但同时又要保留它的抗原性。LPS抗体对动物体免疫保护率较低的原因是最主要由于脂多糖的抗原性较弱。只有在其不对机体造成损伤的前提下提高LPS的抗原性，才能提高LPS对水产养殖动物的免疫保护性。

外膜蛋白OMP也是革兰氏阴性细菌外膜的最重要的一个部分，外膜蛋白与细菌的致病性和免疫保护性紧密相关，在致病过程中起着重要作用。外膜蛋白主要是在细菌细胞的生理过程中起关键作用，它是制备疫苗的一种重要原材料，具有重要的研究价值和广阔的开发前景[80-81]。近年来，病原细菌OMPs的保护抗原性方面一直是外膜蛋白研究的重点内容[52,82]。经研究，OmpW是一种主要的抗原，它在细菌感染中起着非常重要的作用，现在在霍乱弧菌中已经证明OmpW具有一定的免疫原性[83-84]。还有另外一种广泛分别于弧菌和发光菌中的外膜蛋白OmpK，在副溶血弧菌中作为一种宽宿主性噬菌体KVP40的受体[85]。把溶藻弧菌外膜蛋白作为模式抗原制备出ISCOMs，经免疫大黄鱼、进行安全和免疫力试验测定，试验结果表明：溶藻弧菌外膜蛋白是较为安全、纯净的一种抗原；免疫组菌体凝集效价较对照组高，免疫组个体之间也有差异。而免疫组的血清ELISA抗体水平明显高于对照组；攻毒试验组存活率可达100%，对照组存活率为20%；试验表明溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs安全，免疫大黄鱼后可产生免疫保护力[86]。

黄志坚等[87]研究了溶藻弧菌外膜蛋白，结果表明：溶藻弧菌OMP的分子量为58 kDa，OMP的保护性效果比溶藻弧菌灭活菌苗和溶藻弧菌脂多糖好，因此可以证明溶藻弧菌OMP具有相对较强的免疫原性。杨智慧等[88]对溶藻弧菌、哈维氏弧菌V.harveyi、副溶血弧菌等19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列进行克隆和测定，结果发现OmpK基因核苷酸序列之间的相似度在72%～100%。另外，推测氨基酸序列的相似度71%～100%。该研究不仅在基因水平上证实了海水鱼致病性弧菌中广泛存在外膜蛋白OmpK，而且证明了它们之间具有较高的相似度。因此可以推测：外膜蛋白OmpK是溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原，具有一定的研究价值，同时也是一种较好的亚单位疫苗原材料，如果将之作为疫苗的话，有可能会使机体同时对几种病原体产生抗性，为一苗多抗的可能性奠定了理论基础。

将溶藻弧菌的外膜蛋白为模式抗原，制备出ISCOMs，以此免疫大黄鱼，结果显示：获得较高的凝集抗体效价和的免疫保护力，溶藻弧菌的外膜蛋白ISCOMs安全性也较好[86]。这种免疫刺激复合物可以由皂苷将可溶性抗原成分组装成，它的免疫功能较其它常规灭活苗效果显著，已展现了其优越的免疫学价值，为溶藻弧菌的防治开辟了一条新的道路。

[1]STEFAN H,HELMUT W,KARIN N B,et al.Isolation of Vibrio alginolyticus from seawater aquaria[J].Int J Hyg Environ Health,2000,203:169-175.

[2]KANEKO T,COLWELL R R.Ecology of Vibrio parahae-molyticus and related organisms in the Atlantic ocean off South Carolina and Georgia[J].Appl Microbiol,1973,28:1 009-1 017.

[3]林业杰,陈亢川,陈拱立,等.溶藻弧菌噬菌体的分离[J].微生物学报,1993,33(4):285-289.

[4]封会茹,游京蓉,刘玉堂,等.溶藻弧菌引起暴发型食物中毒的病原学研究[J].中国食品卫生杂志,2003,15(4):331-334.

[5]ARDIC N,OZYURT M.Case report:Otitis due to Vibrio alginolyticus[J].Mikrobiyol Bul,2004,38:145-148.

[6]胡超群,陶保华.对虾弧菌病及其免疫预防的研究进展[J].热带海洋,2000,19(3):84-94.

[7]CARLOS R,ALICIAE T,JUAN L B,et al.Association of Aeromonas hydrophila and Vibrio alginolyticus with Larval Mortalities of Scallop(Argopecten purpuratus)[J].Journal of Invertebrate Pathology,1996,67:213-218.

[8]LIU C H,CHEN J C.Effect of ammonia on the immuneresponse of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus[J].Fish&Shellfish Immunology,2004,16:321-334.

[9]BALEBONA M C ZORRILLA I,MORINIGO M A,et al.Survey of bacterial pathologies affecting farmed gilt-heat sea bream(Sparus aurata L.)in southwestern Spain from 1990 to 1996[J].Aquaculture,1998,166:19-35.

[10]鄢庆枇,王 军,苏永全,等.网箱养殖大黄鱼弧菌病研究[J].集美大学学报:自然科学版,2001,6(3):191-196.

[11]黄志坚,何建国.鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性[J].中山大学学报:自然科学版,2002,41(5):64-67.

[12]陈寅儿,金 珊,王国良.鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究[J].台湾海峡,2005,24(1):104-108.

[13]丁 燏,徐 刚.黄鳍鲷弧菌病病原特性及其全菌苗的研究[J].微生物学通报,2004(2):1-5.

[14]李永芹,简纪常,吴灶和.红鳍笛鲷弧菌病病原的研究[J].湛江海洋大学学报,2004,24(6):1-5.

[15]LIU P C,LIN J Y,HSIAO P T,et al.Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased cobia Rachy centroncanadum[J].Journal of Basic Microbiology,2004,44:23-28.

[16]郑国兴,李 何,黄宁宇,等.文蛤病原菌(溶藻弧菌)的分离与性状及病文蛤组织的电镜观察[J].水产学报,1991,15(2):85-95.

[17]陈洪大,于晓莉,叶永庆,等.杂色蛤病原菌-溶藻弧菌的分离与回接感染试验[J].水产科学,1993,12(9):11-14.

[18]林永添.紫贻贝大量死亡原因的初步研究[J].现代渔业信息,2006,21(7):23-26.

[19]张朝霞,王 军,张蕉南,等.东山九孔鲍细菌性疾病研究[J].台湾海峡,2001,20(2):193-199.

[20]SANGSTER C R,SMOLOWITZ R M.Description of Vibrio alginolyticus infection in cultured Sepia officinalis,Sepia apama,and Sepia pharaonis[J].Biol Bull,2003,205:233-234.

[21]李 军,冯 娟,刘 旭,等.香港地区养殖平鲷的病原菌(溶藻胶弧菌)研究[J].水产学报,1998,22(3):275-278.

[22]黄志明.从皮肤溃疡的鮸状黄姑鱼检出弧菌[J].福建农业学报,2002,17(4):223-225.

[23]陈晓燕,胡超群,陈 偿.人工养殖点带石斑鱼弧菌病病原菌的分离及鉴定[J].海洋科学,2003,27:68-72.

[24]LEE K K,YU S R,YANG T I,et al.Isolation and characterization of Vibrio alginolyticus isolated from diseased kuruma prawn,Penaeus japonicus[J].Lett Appl Microbiol,1996,22:111-114.

[25]LEE K K,YU S R,CHEN F R,et al.Virulence of Vibrio alginolyticus isolated from diseased tiger prawn,Penaeus monodon[J].Current Microbiology,1996,32:229-231.

[26]于占国.溶藻弧菌引起中国对虾红腿病的回接实验观察[J].海洋学报,1996,18(6):135-139.

[27]杨季芳,吴友吕,祝希雅.中国对虾养成期细菌性黑鳃、褐斑综合症的病原生物学研究[J].东海海洋,1992,10(4):27-36.

[28]陈 强,鄢庆枇,马 甡.溶藻弧菌致病性研究进展[J].海洋科学,2006,30(8):83-89.

[29]吴后波,潘金培.病原弧菌的致病机理[J].水生生物学报,2003,27(4):422-426.

[30]徐建国.分子医学细菌学[M].北京:科学出版社,2000:131-152.

[31]KRUPESHA SHARMA S R,SHANKAR K M,SATHYANARAYANA M L,et al.Development of biofilm of Vibrio alginolyticus for oral immuno-stimulation of shrimp[J].Aquacult Int,2010.

[32]戴卓捷,杨光明,汪正清.细菌粘附素的分子结构和装配机制[J].微生物学免疫学进展,2001,29(3):55-59.

[33]BAFFONE W,CITTERIO B,VITTORIA E,et al.Determination of several potential virulence factors in Vibrio spp.isolated from seawater[J].Food Microbiology,2001,18:479-488.

[34]ZANETTI S,DERIU A,VOLTERRA L,et al.Virulence factors in Vibrio alginolyticus strains isolated from aquatic environments[J].Ann Ig,2000,12:487-491.

[35]BALEBONA M C,ANDREU M J,BORDAS M A,et al.Pathogenicity of Vibrio alginolyticus for Cultured Gilt-Head Sea Bream(Sparus aurata L.)[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64:4 269-4 275.

[36]BALEBONA M C,MORRINIGO M A,BORREGO J J.Hydro-phobicity and adhesion to fish cells and mucus of Vibrio strains isolated from infected fish[J].Int Microbiol,2001,4:21-26.

[37]钱荣华.溶藻弧菌主要毒力相关基因的克隆、表达及其免疫原性研究[D].2007.

[38]WANG X H,LEUNG K Y.Biochemical characterization of different types of adherence of Vibrio species to fish epithelial cells[J].Microbiology,2000,146:989-998.

[39]MEADOWS P S.The attachment of bacteria to solid surfaces[J].Arch Mikrobiol,1971,75:374-381.

[40]DeBOER W E,GOLTEN G,SCHEFFERS W A.Effects of some physical factors on flagellation and swarming of Vibrio alginolyticus[J].Neth J Sea Res,1975,9:197-213.

[41]BELAS M R,COLWELL R R.Adsorption kinetics of laterally and polarly flagellated Vibrio[J].Journal of Bateriology,1982,151:1 568-1 580.

[42]BORDAS M A,BALEBONA M C,ZORRILLA I,et al.Kinetics of adhesion of selected fish-pathogenic Vibrio strains to skin mucus of Gilt-Head Sea Bream(Sparus aurata L.)[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62:3 650-3 654.

[43]SAKAMOTO K,MAGARIYANMA Y,ISOBE S.A Function of Polar Flagellum and Anisotropic Growth in Vibrio alginolyticus Early-Phase Colonies[J].Current Microbiology,2006,52(6):449-454.

[44]陈昌福,曾妍雄,楠田理一.培养时间对柱状嗜纤维菌脂多糖蛋白质成分和免疫原性的影响[J].华中农业大学学报,2000,19(2):159-162.

[45]陈晓燕,胡超群.溶藻弧菌脂多糖在两种鱼类体内的组织分布[J].热带海洋学报,2002,21(4):30-35.

[46]HISATSUNE K,KIUYE A,KONDO S.A comparative study of the sugar composition of O-antigenic lipopo-lysaccharides isolated from Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus[J].Microbiol Immunol,1981,25:127-136.

[47]陈晓燕,胡超群,任春华,等.溶藻弧菌脂多糖单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用[J].高技术通讯，2002(11):90-95.

[48]鄢庆枇,苏永全,王 军,等.溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验[J].台湾海峡,2003,22(2):163-167.

[49]王蓬勃,马 悦,刘 琴,等.溶藻弧菌铁载体合成及外膜蛋白表达的研究[J].微生物学报,2006,33(2):48-53.

[50]BALEBONA M C,ANDREU M J,BORDAS M A,et al.Pathogenieity of Vibrio alginolyticus for Cultured Gilt-Head Sea Bream(Sparus aurata L.)[J].APPlied and Environment Mierobiology,1998,64:4 269-4 275.

[51]LEE K K,YU S R,YANG T I,et al.Isolation and characterization of Vibrio alginolyticus isolated from diseased kuruma prawn,Pemaeus japonicus[J].Letters in Applied Microbiology,1996,22(2):111-114.

[52]BRIEKNELL I R,KING J A,BOWDEN T J,et al.Duration of Protective antibodies,and the correlation with Protection in Atlantic salmon(Salmo salar L.)following vaccination with an Aeromonas salmonicida vaccine containing iron-regulated outer membrane Proteins and secretory polysaccharide[J].Fish&Shellfish Immunology,1999,9:139-151.

[53]LITWIN C M,BYRNE B L.Cloning and charaeterization of an outer membrane Prote of Vibrio vulnificus required for heme utilization:regulation of expressiona determination of the genes sequence[J].Infect Immun,1998,66:3 134-3 141.

[54]SIMON M,MATHES A,BLANCH A,et al.Charaeterization of aporin from the outer membrane of Vibrio anguillarum[J].Bacteriol,1996,178:4 182-4 188.

[55]林业杰,董新平,欧剑鸣,等.溶藻弧菌的致病性研究[J].海峡预防医学杂志,1998,4(4):1-2.

[56]BALEBLONA M C,MORINIGO M A,BORREGO J J.Roleof extracellular products in the pathogenicity of Vibrio strains on cultured gilt-head seabream(Sparus aurata)[J].Microbiologia,1995,11:439-446.

[57]LEE K K,CHEN F R,YU S R,et al.Effeets of extracellular products of Vibrio alginolyticus on penaeid prawn plasma components[J].Lett Appl Microbiol,1997,25(2):98-100.

[58]左凤琴,简纪常,吴灶和.鱼源溶藻弧菌胞外产物的特性研究[J].水生生物学报,2006,30(5):553-558.

[59]TORANZO A E,BARJA J L,POTTER S A,et al.Hemagglutinating,haemolytic and cytotoxic activities of Vibrio anguillarum and related vibrioses issolated from striped bass on the Atlantic Coast[J].FEMS Microbiol Lett,1983,18:257-262.

[60]BAFFONE W,CITTERIO B,VIITTORIA E,et al.Determination of several potential virulence factors in Vibrio spp.isolated from seawater[J].Food Microbiology,2001,18:479-488.

[61]权太淑,李 摄,杨喜玲.腹泻患者中分离溶藻弧菌及其病原性的探讨[J].中国公共卫生,1985,4(5):15-28.

[62]LONG S,MOTHIBELI M A,ROBB F T.Regulation of extracellular alkaline Protease activity by histidine in a collagenolytic Vibrio alginolyticus strain[J].Gen Mierobiol,1981,127(1):193-199.

[63]CHEN F R,LIU P C,LEE K K.Purification and partial characterization of a toxic serine protease produced by pathogenic Vibrio alginolyticus[J].Microbios,1999,98:95-111.

[64]CHEN F R,LIU P C,LEE K K.Lethal attribute of serine protease secreted by Vibrio alginolyticus strains in kuruma prawn Penaeus japonieus[J].Z Naturforsch,2000,55(1/2):94-99.

[65]HARE P,LONG S,ROBB F T,et al.Regulation of exoprotease production by temperature and oxygen in Vibrio alginolyticus[J].Arch Microbiol,1981,130:276-280.

[66]HARE P,SEOTT-BURDEN T,WOODS D R.Characterization of extracellular alkaline proteases and collagenase induction in Vibrio alginolyticus[J].Gen Microbiol,1983,129:1 141-1 147.

[67]DEANE S M,ROBB F T,WOODS D R.Isolation and characterization of a Vibrio alginolyticus mutant that overproduces extracellular proteases[J].Gen Microbio,1986,132:893-898.

[68]DEANE S M,ROBB F T,WOODS D R.Production and activation of an SDS-resistant alkaline serine exoprotease of Vibrio alginolyticus[J].Gen Microbiol,1987,133:391-398.

[69]DEANE S M,ROBB F T,ROBB S M.Nucleotide sequenee of the Vibrio alginolyticus calcium-dependent,detergent-resistant alkaline serine exoprotease A[J].Gene,1989,76:281-288.

[70]LEE K K,YU S R,YANG T I,et al.Alkaline serine protease is an exotoxin of Vibrio alginolyticus in kuruma prawn,Penaeus japonicus[J].Current Microbiology,1997,34(2):110-117.

[71]蔡双虎,鲁义善,吴灶和,等.溶藻弧菌asp基因在大肠杆菌中表达活性研究及条件优化[J].广东海洋大学学报,2008,28(3):45-49.

[72]SEIFTER S,HARPER E.Collagenase[J].Methods Enzymol,1970,19:613.

[73]LWEBUGA-MUKASA J S,HARPER E,TAYLOR P.Collagenase enzymes from Clostridium:characterization of individual Enzymes[J].Biochemistry,1976,15:4 736-4 741.

[74]PETERKOFSKY B.Bacterial collagenases[J].Methods Enzymol,1982,82:453-481.

[75]管正玉,程洪伟,孙广慈,等.人体正常皮肤及增生性瘢痕组织胶原酶活性检测的观察[J].中华整形烧伤外科杂志,1997,13(2):121-123.

[76]王海芳,孙际佳,赵典惠,等.溶藻弧菌疫苗对黑鲷的免疫效果研究[J].华南农业大学学报,2008,29(1):97-104.

[77]曹剑香,简纪常,吴灶和.溶藻弧菌疫苗对凡纳滨对虾免疫功能的影响[J].湛江海洋大学学报,2004,24(6):11-17.

[78]刘振兴.鱼类弧菌疫苗的开发与利用现状(上)[J].渔业致富指南,2009,(21):63-64.

[79]DING X Z,SMALLRIDGE R C,GALLOWAY R J,et al.Rapid assay of HSF1 and HSF2 gene expression by RT-PCR[J].Mol Cell Biochem,1996,158:189-192.

[80]PIZZA M,SCARLATO V,MASIGNANI V,et al.Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing[J].Seience,2000,287:1 816-1 820.

[81]FANG H M,LING K C,GE R,et al.Enhancement of protective immunity in blue gourami,Trichogaster trichopterus(Pallas),against Aeromonas hydrophila and Vibrio anguillarum by A.hydrophila major adhesion[J].Fish Dis,2000,23:137-45.

[82]HLADY W G,KLONTZ K C.The epidemiology of Vibrio infections in Florida,1981-1993[J].Infect Dis,1996,173:1 176-1 183.

[83]WENTWORTH,B B.Diagnostic Procedures for baeterial infections[J].American Public Health Association,1987,1:599-611.

[84]MORRIS J G,BLAEK R E.Cholera and other Vibrioses in the United States[J].N Engl Med,1985,312:343-350.

[85]王斌福,林能锋,俞伏松,等.大黄鱼溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs的免疫效果初步研究 [J].福建农业学报,2008,23(3):244-246.

[86]黄志坚,何建国.溶藻弧菌外膜蛋白(Va-OMP)的免疫原性及免疫保护性[J].水产学报,2006,30(4):538-542.

[87]杨智慧,李宁求,白俊杰,等.19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析 [J].中国水产科学,2006,13(5):807-813.